модуль 1

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ`Я УКРАЇНИ

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

СУМСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

КУРС ЛЕКЦІЙ ІЗ БІОХІМІЇ

для студентів спеціальності 7.110101

денної форми навчання

Розділ

«Структура та функції білків»

Затверджено

на засіданні кафедри біофізики, біохімії, фармакології та біомолекулярної інженерії як курс лекцій із дисципліни «Біологічна хімія».

Протокол № 25   від   13.05.2013 р.

 

Суми

Сумський державний університет

2013

Курс лекцій із біохімії. Розділ  «Структура та функції білків» / укладачі: І. В. Чорна, І. Ю. Висоцький. – Суми : Сумський державний університет, 2013. – 72 с.

Кафедра біофізики, біохімії, фармакології та біомолекулярної інженерії

ЗМІСТ
	C.
Передмова.....................................................................................	...........5
1. Загальна характеристика та біологічні функції білків і пептидів........................................................................................	...........6
2. Амінокислотний склад білків і пептидів...............................	............7
2.1. Будова та класифікації амінокислот...................................	............7
2.2. Функціональна роль протеїногенних амінокислот............	........12
2.3. Фізико-хімічні властивості протеїногенних амінокислот..................................................................................	..........14
2.3.1. Кислотно-основні властивості.........................................	..........14
2.3.2. Стереоізомерія....................................................................	.........20
2.3.3. Спектральні властивості...................................................	.........21
2.3.4. Полярність..........................................................................	.........21
3. Методи виявлення та дослідження в біологічних рідинах амінокислот....................................................................	.........22
3.1. Кольорові реакції на амінокислоти.....................................	.........22
3.2. Розділення амінокислот за допомогою іонообмінної хроматографії...............................................................................	.........24
4. Рівні структурної організації білкових молекул...................	.........25
5. Природні пептиди: класифікація, біохімічна характеристика............................................................................	.........36
6. Сучасні класифікації білків. Загальна характеристика окремих класів білків, їх роль...................................................	.........40
7. Фізико-хімічні властивості білків..........................................	.........48
8. Етапи дослідження первинної структури білків і пептидів........................................................................................	.........53
8.1. Методи виділення білків із біооб’єктів..............................	.........53
8.2. Методи фракціонування білків...........................................	.........54
8.2.1. Відділення білків від низькомолекулярних домішок.....	.........54
8.2.2. Розділення білків за молекулярною масою.....................	.........54
8.2.3. Розділення білків за зарядом............................................	.........57
8.2.4. Розділення білків за зарядом і молекулярною масою....	.........58
8.2.5. Розділення білків за здатністю до специфічних взаємодій......................................................................................	.........61
8.3. Аналіз будови білків.............................................................	.........62
8.3.1. Аналіз гомологічних білків...............................................	.........62
8.3.2. Встановлення амінокислотного складу білка.................	.........63
8.3.3. Визначення N-кінцевої амінокислоти..............................	.........64
8.3.4. Визначення С-кінцевої амінокислоти.............................	.........67
8.3.5. Визначення амінокислотної послідовності білкового ланцюга.......................................................................	.........67
9. Коротка історична довідка......................................................	.........68
Список використаної літератури................................................	.........69
Додаток А......................................................................................	.........71

Передмова

У запропонованому курсі лекцій стисло і доступно висвітлені основні положення про будову і функції одного із основних класів біомакромолекул – білків. Багато уваги приділено принципам структурної організації, класифікації та фізико-хімічним властивостям білків і амінокислот. Наведено детальний опис основних методів дослідження, що застосовуються в сучасній біохімії для виділення, очищення, розділення білків та аналізу амінокислотної послідовності білкового ланцюга (висолювання, ультрацентрифугування, хроматографічні, електрофоретичні методи, секвенування та ін.). Конспект ілюстрований.

Вивчення хімії білків і методів дослідження цих біомолекул важливе як для формування фундаментальних уявлень про молекулярну основу життя, так і для подальшого розуміння студентами-медиками причин виникнення і перебігу патохімічних процесів, що лежать в основі розвитку ряду захворювань. Автори мають надію, що запропонований курс лекцій із розділу «Структура та функції білків» дасть можливість студентам краще підготуватися до практичних занять із біологічної хімії, а також сприятиме ефективнішому вивченню ними інших клінічних дисциплін.

1. Загальна характеристика та біологічні функції білків і пептидів

Білки – це високомолекулярні природні полімери, що складаються з амінокислотних залишків, з’єднаних пептидним зв’язком; є головною складовою частиною живих організмів і молекулярною основою процесів життєдіяльності.

Біологічні функції білків і пептидів:

1. Каталітична функція. Більше 3400 білків є ферментами.

2. Скорочувальна функція. Білки беруть участь у механічному скороченні для здійснення руху (мають, як правило, аденозинтрифосфатазну активність): актин і міозин м’язів,  білки джгутиків та війок найпростіших, джгутиків сперматозоїдів, тубулін апарату руху хромосом у процесі мітозу та ін.

3. Структурна функція. Основними структурними білками є колаген, еластин (формують кістковий матрикс, судинну систему та ін. органи), α-кератин (наявний у епідермальній тканині), білки плазматичних мембран та ін.

4. Транспортна функція. Білки зв’язують та здійснюють транспорт у крові та клітині різних лігандів – біомолекул, іонів металів, чужорідних хімічних сполук (ксенобіотиків). Прикладами транспортних білків є альбумін сироватки крові (переносить жирні кислоти, білірубін, лікарські й токсичні сполуки), гемоглобін еритроцитів (транспортує кисень), ліпопротеїни (транспортують ліпіди), трансферин (транспортує залізо) та ін.

5. Захисна функція. До білків, що виконують дану функцію, належать антитіла (імуноглобуліни), які виробляються у відповідь на введення антигенів; білки системи згортання крові; білки системи комплементу; ферменти знешкодження ксенобіотиків; інтерферони, інтерлейкіни, лізоцим та ін.

6. Регуляторна функція. Білкову та пептидну природу мають численні біорегулятори – гормони, медіатори та модулятори, що виробляються в ендокринній системі, нейронах головного мозку, імунній системі: прості білки (інсулін, соматотропін, пролактин тощо), глікопротеїни (тиреотропін, фолікулостимулювальний гормон, лютеїнізуючий гормон тощо), низькомолекулярні пептиди (вазопресин, окситоцин, опіоїдні пептиди мозку тощо). Прикладами регуляторних білків є також гістони, що стабілізують структуру ДНК і регулюють функціонування геному; гетерогенна група негістонових білків (М.м. 5–200 кДа), які беруть участь у формуванні нуклеосом і взаємодії із хроматином гормон-рецепторних комплексів, у регуляції процесів реплікації, транскрипції і трансляції; білки теплового шоку (стресові білки); G-білки, що регулюють синтез циклічних нуклеотидів; онкобілки та антионкобілки, що визначають малігнізацію клітини.

7. Участь у підтриманні рН крові (гемоглобінова та білкова буферні системи).

8. Рецепторна функція. Рецепторні білки у внутрішньому середовищі організму служать для взаємодії із молекулами-біорегуляторами (сигнальними молекулами). Локалізуються в мембранних структурах клітин, а також можуть бути у розчиненому стані. Так, білкову природу мають мембранні рецептори для фізіологічно активних сполук, що приймають хімічний сигнал від гормонів, нейромедіаторів (адренорецептори, холінорецептори, гістамінові рецептори тощо). Для сприйняття сигналів зовнішнього середовища відомі фоторецепторні білки (опсин), для сприйняття звуку холінорецепторні білки тощо.

9. Участь у підтриманні онкотичного тиску в клітинах і крові (альбумін).

10. Енергетична функція (дуже незначною мірою, оскільки продукти гідролізу білка є джерелом енергії лише в особливих умовах, наприклад, при голодуванні).

2. Амінокислотний склад білків і пептидів

2.1. Будова та класифікації амінокислот

При гідролізі природних білків та пептидів вивільняється близько 20 різних α-L-амінокислот, розміщення кожної з яких у поліпептидному ланцюгу кодується триплетом нуклеотидів у ДНК геному.

Амінокислоти поділяють на:

-        протеїногенні (20 амінокислот, що входять до складу природних білків і пептидів);

-        непротеїногенні (їх є більше 150, не входять до складу природних білків і пептидів).

Протеїногенні амінокислоти є α-амінокислотами (крім проліну). Вони мають загальну хімічну структуру:

 

Рамкою обведено частину, яка є однаковою для всіх амінокислот. Відрізняються між собою амінокислоти за будовою бічного ланцюга (R-групи).

 

 

Амінокислоти класифікують декількома способами залежно від ознаки, за якою відбувається їх розподіл на групи. Прийнято такі класифікації амінокислот:

I Структурна – за будовою бічного радикала:

1.                  Ациклічні амінокислоти

Аліфатичні незаміщені амінокислоти (моноаміно-монокарбонові) – гліцин, аланін, валін, лейцин, ізолейцин.

Аліфатичні заміщені амінокислоти

·      Гідроксіамінокислоти (серин, треонін).

·      Сірковмісні (метіонін, цистеїн).

·      Карбоксіамінокислоти (моноамінодикарбонові кислоти) – аспарагінова кислота, глутамінова кислота.

·      Аміди дикарбонових кислот (аспарагін, глутамін).

·      Диамінокислоти (диаміномонокарбонові кислоти) – лізин, аргінін.

2.                  Циклічні амінокислоти

      Ароматичні амінокислоти (фенілаланін, тирозин).

      Гетероциклічні амінокислоти (триптофан, гістидин).

      Циклічна імінокислота (пролін).

II За полярністю радикалів, тобто здатністю амінокислот до взаємодії із водою при фізіологічних значеннях pН (близько pН 7,0):

1.            Неполярні (гідрофобні) (аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, триптофан, метіонін).

2.            Полярні незаряджені (гліцин, серин, треонін, тирозин, цистеїн, аспарагін, глутамін).

3.            Полярні негативно заряджені (глутамінова кислота, аспарагінова кислота).

4.            Полярні позитивно заряджені (лізин, аргінін, гістидин).

IIІ За кислотно-основними властивостями:

1.            Кислі – із додатковими карбоксильними групами в боковому радикалі (моноамінодикарбонові кислоти: аспарагінова і глутамінова).

2.            Основні – диаміномонокарбонові (лізин, аргінін) і гістидин.

3.            Нейтральні – решта амінокислот, у яких боковий радикал не проявляє ні кислих, ні основних властивостей.

IV Біологічна (фізіологічна) – за мірою незамінності амінокислот для організму:

1.                  Замінні амінокислоти. Серед 20 протеїногенних амінокислот 8 амінокислот в організмі людини у достатній кількості синтезуються de novo з інших інтермедіатів (аланін, аспарагінова кислота, аспарагін, глутамінова кислота, глутамін, пролін, гліцин, серин).

2.                  Незамінні (есенціальні) амінокислоти – не синтезуються ферментними системами організму людини, тому повинні обов’язково надходити із харчовими продуктами (валін, лейцин, ізолейцин, фенілаланін, триптофан, метіонін, треонін, лізин).

3.                  Частково замінні амінокислоти – синтезуються в організмі у недостатній кількості (аргінін, гістидин).

4.                  Умовно замінні амінокислоти – синтезуються в організмі із незамінних амінокислот: цистеїн (синтезується із незамінної амінокислоти метіоніну), тирозин (синтезується із незамінної амінокислоти фенілаланіну).

Нестандартні амінокислоти у складі білків:

-        g-карбоксиглутамінова кислота (протромбін: згортання крові);

-        4-гідроксипролін, 5-гідроксилізин (білки сполучної тканини: колаген);

-        десмозин (конденсація чотирьох молекул лізину: сполучна тканина);

-        дийодтирозин (тиреоглобулін: гормони щитовидної залози).

2.2. Функціональна роль протеїногенних амінокислот

Аланін – використовується для синтезу каротиноїдів, каучука, жирів і вуглеводів.

Валін – бере участь у синтезі алкалоїдів, деяких циклічних пептидів, пантотенової кислоти, пеніциліну.

Лейцин, ізолейцин – є джерелами сивушних масел при бродінні.

Пролін – міститься у великій кількості у білках-проламінах насіння злаків, у колагені, еластині й білках емалі зубів; входить до складу ряду антибіотиків – циклічних пептидів (граміцидини, актиноміцин D).

Фенілаланін – бере участь у біосинтезі флавоноїдів, алкалоїдів.

Триптофан – слугує для синтезу індолілалкіламінів (серотонін), нікотинової кислоти.

Метіонін – основний донор метильних груп (у вигляді        S-аденозилметіоніну) при біосинтезі біологічно активних сполук (холіну, нуклеотидів та ін.); із нього утворюється цистеїн; є ліпотропним фактором, необхідним для підтримання функції печінки та обміну ліпідів; високий вміст метіоніну відмічений у твердому сирі.

Гліцин – єдина оптично неактивна амінокислота; значно поширена, особливо багато гліцину міститься у желатині; є попередником у синтезі пуринів, гемоподібних структур і колагену; входить до складу трипептиду глутатіону; використовується для побудови клітинних стінок бактерій; є гальмівним медіатором центральної нервової системи.

Серин – входить до складу фосфоліпідів (фосфатидилсерин), поліпептидів брадикініну й калідину; бере участь у побудові активного центру серинових протеїназ, синтезі аміноспирту сфінгозину; у казеїні молока або вітеліні яєчного жовтка міститься у вигляді серинфосфорної кислоти.

Треонін – бере участь у синтезі вітаміну В₁₂, антибіотика актиноміцину D.

Тирозин – є вихідною речовиною для синтезу гормонів (тироксин, адреналін), алкалоїдів (морфін, кодеїн, папаверин), меланіну.

Цистеїн – входить до складу глутатіону, а у вигляді аміну – до складу коферменту А. Ця амінокислота завдяки активній SH-групі легко вступає в окисно-відновні реакції, захищаючи клітину від дії окисників, бере участь в утворенні дисульфідних містків, що стабілізують структуру білків; входить до складу активного центру цистеїнових ферментів.

Аспарагінова кислота, аспарагін. У великій кількості аспарагінова кислота міститься у рослинних білках; бере участь у реакціях трансамінування і синтезі сечовини, креатину, циклічних пептидів; при декарбоксилюванні утворюються α- або β-аланін, необхідний для синтезу м’язових дипептидів карнозину, анзерину й коферменту А; амід аспарагінової кислоти – аспарагін накопичується при проростанні насіння бобових рослин у темряві або при надлишку аміаку; у вищих тварин аспарагінова кислота й аспарагін беруть участь у синтезі пуринових і піримідинових основ, нікотинової кислоти.

Глутамінова кислота, глутамін. Глутамінова кислота входить до складу фолієвої кислоти та глутатіону; бере участь у реакціях трансамінування, непрямого дезамінування; при декарбоксилюванні глутамінової кислоти утворюється               γ-аміномасляна кислота (ГАМК) – гальмівний медіатор центральної нервової системи; є попередником у синтезі порфіринів; глутамат натрію є смаковою приправою. Глутамін є вихідною сполукою у синтезі пуринових і піримідинових основ, нікотинової кислоти.

Лізин – високий вміст у протамінах і гістонах; є вихідним продуктом для синтезу алкалоїдів (анабазин, нікотин), своєю    ε-аміногрупою лізин бере участь в утворенні комплексу між білковою частиною ферменту і коферментом (біотин-залежні ферменти карбоксилази).

Аргінін – високий вміст у протамінах і гістонах; бере участь у синтезі креатину; утворення аргініну є частиною метаболічного шляху знешкодження аміаку (синтез сечовини).

Гістидин – міститься у великій кількості у глобіні – білковому компоненті гемоглобіну; при декарбоксилюванні гістидину утворюється гістамін, що регулює проникність тканин і виявляє свою дію при алергії; входить до складу активних центрів деяких протеолітичних ферментів.

2.3. Фізико-хімічні властивості протеїногенних амінокислот

2.3.1. Кислотно-основні властивості. Амінокислоти мають радикал і дві функціональні групи із протилежними властивостями: кислу – карбоксильну та основну – аміногрупу. Амінокислоти є амфотерними електролітами, що можуть дисоціювати з утворенням іонних форм – аніона або катіона. У водному середовищі амінокислоти існують у вигляді рівноважної суміші, що складається з аніонної, катіонної форм та біполярного іона (цвітер-іона).

 

Зазначені реакції утворення аніонів, катіонів та біполярних іонів амінокислот повністю відповідають тільки схемі кислотно-основної дисоціації моноаміномонокарбонових амінокислот. У цьому найпростішому випадку рівновага між позитивно та негативно зарядженими молекулами може теоретично досягатися вже в нейтральних розчинах, тобто при рН=7.

Таким чином, нейтральні амінокислоти у воді мають сумарний нульовий заряд і можуть функціонувати або як кислоти (донори протонів), або як основи (акцептори протонів). Речовини з такими подвійними властивостями є амфотерними (із грецької “amphi” – обидва) і часто їх називають амфолітами, (скорочення від слів амфотерні електроліти).

Кислі (моноамінодикарбонові) амінокислоти мають дві карбоксильні групи, які дисоціюють, віддаючи 2 протони, але оскільки в них тільки одна аміногрупа, що приймає один протон, то такі амінокислоти поводять себе як кислоти та їх розчин має кислу реакцію. Сам іон амінокислоти заряджається негативно (сумарний заряд “-1”).

Основні (диаміномонокарбонові) амінокислоти реагують у водному розчині як слабкі основи, оскільки один протон, який вивільняється при дисоціації карбоксильної групи таких амінокислот, зв’язується з однією з аміногруп, а друга аміногрупа зв’язує протон із водного оточення, у результаті збільшується кількість OH^– груп і підвищується pH. Заряд іона таких амінокислот буде позитивним (сумарний заряд “+1”).

При додаванні до розчину амінокислот додаткової кількості протонів (кислоти) пригнічується дисоціація карбоксильних груп та збільшується кількість позитивно заряджених NH₃⁺-груп. Отже, у сильно кислому середовищі всі амінокислоти переходять у катіонну форму (набувають позитивного заряду). При додаванні лугу, навпаки, збільшується дисоціація карбоксильних груп. Отже, у сильно лужному середовищі всі амінокислоти переходять у аніонну форму (набувають негативного заряду). Таким чином, змінюючи pH розчину, можна змінювати заряд молекул амінокислот.

Таблиця 1 – Зміна сумарного заряду амінокислот залежно від рН середовища

(за Є. С. Северіним та ін.)

 

При певному значенні pH середовища настає такий стан, при якому заряд амінокислоти дорівнює нулю. Таке значення pH називається ізоелектричною точкою (ІЕТ) і позначається рI. При значенні pH, що дорівнює ізоелектричній точці, амінокислота не переміщується в електричному полі. Якщо pH нижче ІЕТ, то катіон амінокислоти рухається до негативно зарядженого катода, а при pH вище ІЕТ аніон амінокислоти – до позитивно зарядженого анода. На цих властивостях амінокислот базується можливість їх розділення в електричному полі (електрофорез). Для нейтральних α-амінокислот значення ІЕТ є дещо нижчими ніж 7 (5,5-6,3) унаслідок більшої здатності до іонізації карбоксильної групи. У кислих α-амінокислот (аспарагінова і глутамінова кислоти) ІЕТ знаходиться значно нижче 7, наприклад, для аспарагінової кислоти рІ=2,97 і при фізіологічних значеннях рН (наприклад, крові 7,36–7,44) вони знаходяться у вигляді аніонів, оскільки у них іонізовані обидві карбоксильні групи. Для лужних амінокислот ІЕТ знаходиться у межах рН вище 7, і в організмі вони містяться у вигляді катіонів, тобто в них протонізовані обидві аміногрупи. Крім того, при рН=рІ амінокислоти мають найнижчу розчинність у воді.

На рисунку 1 подано криву титрування на прикладі амінокислоти гліцину. Титрування відбувається через дві стадії, кожна з яких відповідає відщепленню одного протона. На самому початку титрування гліцину його молекули знаходяться у повністю протонованій формі, і в розчині переважають іони ⁺NH₃–CH₂–COOH. У середній точці ділянки кривої, що відповідає першій стадії титрування, коли відбувається відщеплення протона від карбоксильної групи, наявні еквімолярні концентрації донора (⁺NH₃–CH₂–COOH) та акцептора (⁺NH₃–CH₂–COO^–) протонів. У даному випадку середній точці кривої на першій стадії титрування відповідає рН 2,34, отже, величина константи дисоціації α-СООН-групи гліцину (pK₁’) дорівнює 2,34. Продовжуючи титрування, ми досягнемо другої важливої точки, що відповідає рН 5,97, – точки перегину кривої. Саме в цей момент закінчується стадія відщеплення першого протона і починається стадія відщеплення другого протона. При цьому значенні рН гліцин знаходиться переважно у формі біполярного іона ⁺NH₃–CH₂–COO^–, і його заряд дорівнює нулю. Таким чином, рН 5,97 є ізоелектричною точкою для гліцину.

На другій стадії титрування відбувається відщеплення протона від ⁺NH₃-групи гліцину. Середня точка цієї ділянки кривої титрування відповідає еквімолярним концентраціям іонів ⁺NH₃–CH₂–COO^– і NH₂–CH₂–COO^–. Значення рН у цій точці дорівнює 9,60, таке саме значення має і константа дисоціації     α-⁺NH₃-групи гліцину (pK₂’). Титрування завершується приблизно при рН 12, коли гліцин знаходиться переважно у формі повністю депротонованих іонів NH₂–CH₂–COO^–.

Значення ІЕТ для амінокислот, що містять одну                    α-аміногрупу, одну α-карбоксильну групу і бічний радикал, що не дисоціює, може бути обчислене, використовуючи таку  формулу:

pI = ½( pK₁’+ pK₂’),

де pK₁’ – константа дисоціації α-СООН-групи амінокислоти;

pK₂’ – константа дисоціації α-⁺NH₃-групи амінокислоти.

Для гліцину pI = ½( 2,34+ 9,60)=5,97.

 

Рисунок 1 – Крива титрування 0,1 М гліцину

Амінокислоти, які мають дві карбоксильні групи (моноамінодикарбонові кислоти), титруються в 3 етапи:

1)                 дисоціація α-СООН-групи амінокислоти;

2)                 дисоціація СООН-групи бічного радикала;

3)                 дисоціація α-⁺NH₃-групи амінокислоти.

Значення ІЕТ для амінокислот, що містять дві карбоксильні групи та одну α-аміногрупу, може бути обчислене, використовуючи таку формулу:

pI = ½( pK₁’+ pK₂’),

де pK₁’ – константа дисоціації α-СООН-групи амінокислоти;

pK₂’ – константа дисоціації СООН-групи бічного радикала.

Для глутамінової кислоти pI = ½( 2,19+ 4,25)=3,22.

Амінокислоти, які мають дві аміногрупи (диаміномонокарбонові кислоти), титруються в 3 етапи:

1)                 дисоціація α-СООН-групи амінокислоти;

2)                 дисоціація α-⁺NH₃-групи амінокислоти;

3)                 дисоціація ⁺NH₃-групи бічного радикала.

Значення ІЕТ для амінокислот, що містять дві аміногрупи та одну α-карбоксильну групу, може бути обчислене, використовуючи таку формулу:

pI = ½( pK₁’+ pK₂’),

де pK₁’ – константа дисоціації α-⁺NH₃-групи амінокислоти;

pK₂’ – константа дисоціації ⁺NH₃-групи бічного радикала.

Для аргініну pI = ½(9,04+ 12,48)=10,76.

У цистеїні та тирозині R-група бічного радикала іонізується раніше, ніж α-⁺NH₃-група, тому значення ІЕТ для цих амінокислот може бути обчислене, використовуючи таку формулу:

pI = ½( pK₁’+ pK₂’),

де pK₁’ – константа дисоціації α-СООН-групи амінокислоти;

pK₂’ – константа дисоціації R-групи бічного радикала.

Для цистеїну pI = ½(1,71+ 8,33)=5,02.

Для тирозину pI = ½(2,20+ 9,11)=5,65.

У таблиці А. 1 наведені значення pK дисоціації α-СООН-,    α-⁺NH₃- та R-груп протеїногенних амінокислот.

2.3.2. Стереоізомерія. Усі α-амінокислоти, крім гліцину, оптично активні і можуть існувати у вигляді L- або D-стереоізомерів. Стереоізомерія зумовлена наявністю в амінокислоті асиметричного α-вуглецевого атома (називається хіральний центр), біля якого розташовані чотири різні функціональні групи.

 

До складу білків організму людини і тварин входять тільки амінокислоти, що мають L-конфігурацію. У їх проекціях аміногрупа знаходиться ліворуч подібно до гідроксигрупи в L-гліцериновому альдегіді.

 

Використання α-амінокислот L-ряду для біосинтезу білків людського організму має надзвичайно важливе значення у формуванні їх просторової структури та виявленні біологічної активності. Із цим безпосередньо пов’язана стереоспецифічність дії ферментів-білків. Залишки D-α-амінокислот входять до складу багатьох природних пептидів, насамперед антибіотиків. D-амінокислоти знайдено у складі біополімерів клітинних стінок бактерій. Наприклад, залишок D-глутамінової кислоти входить до оболонки бактерій сибірської виразки.

Цікаво Залишки аспарагінової кислоти в метаболічно неактивних структурних білках зазнають повільної мимовільної неферментативної рацемізації: так, у білках дентину й емалі зубів L-аспартат переходить у D-форму зі швидкістю ~ 0,1% на рік, що може бути використано для визначення віку ссавців. Рацемізація залишків аспарагінової кислоти також виявлена при старінні колагену, передбачається, що така рацемізація специфічна для аспарагінової кислоти і відбувається за рахунок утворення сукцинімідного кільця при внутрішньо-молекулярному ацилюванні пептидного азоту вільною карбоксильною групою аспарагінової кислоти

 

2.3.3                   . Спектральні властивості. Усі амінокислоти поглинають світло в інфрачервоній області спектру. В ультрафіолетовій області поглинають світло три циклічних амінокислоти: тирозин, триптофан (λ_max=280 нм) і фенілаланін (λ_max=260 нм). Цю властивість широко використовують для аналітичного визначення білків.

2.3.4                   . Полярність. Залежно від полярності бічних радикалів (R-груп) амінокислоти в більшій або меншій мірі взаємодіють із диполями води, тобто проявляють гідрофільні або гідрофобні властивості.

3. Методи виявлення та дослідження в біологічних

рідинах амінокислот

3.1.Кольорові реакції на амінокислоти

Нінгідринова реакція. Вільні α-амінокислоти утворюють комплекс синьо-фіолетового кольору з нінгідрином (трикетогідринденгідратом). Реакція полягає у тому, що при нагріванні α-амінокислоти із розчином нінгідрину                       α-амінокислоти окиснюються киснем нінгідрину і зазнають окиснювального дезамінування з утворенням аміаку і декарбоксилювання з утворенням альдегіду та СО₂. Нінгідрин при цьому відновлюється.

 

Відновлений нінгідрин конденсується з аміаком і окисненою молекулою нінгідрину, утворюючи продукт конденсації, забарвлений у фіолетово-синій колір.

 

Ця реакція широко використовується для кількісного визначення амінокислот і пептидів.

Флуорескамінова реакція. Ця реакція більш чутлива, ніж нінгідринова. Флуорескамін утворює з α-амінокислотами флуоресціюючі комплекси. Сам флуорескамін і продукти його гідролізу не флуоресціюють, тому вони не заважають кількісному визначенню продуктів реакції.

Ксантопротеїнова реакція. Ксантопротеїнова реакція характерна для циклічних амінокислот тирозину і триптофану. Цю реакцію дають також прості ароматичні сполуки, наприклад, фенол, бензол. Ксантопротеїнова реакція полягає у тому, що тирозин і триптофан при нагріванні із концентрованою нітратною кислотою утворюють нітропохідні жовтого кольору. Циклічна амінокислота фенілаланін нітрується лише в суміші концентрованих сульфатної та нітратної кислот. Нітропохідні амінокислот у лужному середовищі утворюють солі хіноїдної природи, забарвлені в оранжевий колір. Назва ксантопротеїнова походить від грецького “xanthos” – жовтий. Дана реакція характеризується високою чутливістю.

Реакція Мілона. Це специфічна реакція на тирозин (амінокислоту, що містить фенольний гідроксил). В умовах нагрівання фенолів та їх похідних із реактивом Мілона (нітрат меркурію (I та II) у 4М HNO₃, що містить домішки HNO₂) утворюється забарвлена в червоний колір сіль орто-нітротирозину меркурію.

Реакція Сакагучі. Реакція застосовується для ідентифікації гуанідинової групи амінокислоти аргініну. При взаємодії гуанідину з гіпобромітом натрію (NaBrO) та α-нафтолом у лужному середовищі утворюються сполуки з червоним забарвленням.

Реакція Ерліха. Реакція застосовується для виявлення індольного кільця триптофану , яке при взаємодії з п-диметиламінобензальдегідом у кислому середовищі дає сполуки з фіолетовим забарвленням.

Реакція Фоля. Реакція застосовується для визначення цистеїну та цистину – амінокислот, що містять у своєму складі слабозв’язану сірку. Принцип визначення полягає в тому, що при кип’ятінні зазначених амінокислот із розчином лугу відбувається відщеплення сульфідної сірки. Останню легко виявити за реакцією утворення чорно-бурого осаду сульфіду плюмбуму (II). Метіонін не вступає в реакцію Фоля, оскільки в даній амінокислоті сірка зв’язана міцно і не відщеплюється при дії лугу.

3.2. Розділення амінокислот за допомогою іонообмінної хроматографії

Іонообмінна хроматографія амінокислот ґрунтується на різній здатності амінокислот, які розділяють, до іонного обміну з тим чи іншим іонітом. Суміш амінокислот, отриманих кислотним гідролізом білків, розділяють на хроматографічній колонці з катіонообмінною смолою. Така синтетична смола містить міцно зв’язані негативно заряджені групи (наприклад, залишки сульфонової кислоти-SO^3-), до яких приєднані іони Na⁺. На катіонообмінник наносять суміш амінокислот у кислому середовищі (рН 3,0), де амінокислоти в основному являють собою катіони, тобто несуть позитивний заряд. Позитивно заряджені амінокислоти приєднуються до негативно заряджених частинок смоли. Чим більший сумарний заряд амінокислоти, тим міцніший її зв’язок зі смолою. Так, амінокислоти лізин, аргінін і гістидин зв’язуються із катіонообмінниками найміцніше, а аспарагінова і глутамінова кислоти – найслабше. Вивільнення амінокислот із колонки здійснюється шляхом вимивання (елюювання) їх буферним розчином зі зростаючою іонною силою (тобто зі збільшенням концентрації NaCl) і рН. При збільшенні рН середовища амінокислоти втрачають протон, у результаті зменшується їх позитивний заряд, а отже, і міцність зв’язування з негативно зарядженими частинками смоли. Кожна амінокислота виходить із колонки при певному значенні рН і іонної сили. Збираючи з нижнього кінця колонки розчин (елюат) у вигляді невеликих порцій, можна отримати фракції, що містять окремі амінокислоти.

4. Рівні структурної організації білкових молекул

Первинна структура білків – це конфігурація поліпептидного ланцюга, яка формується в результаті утворення кислотоамідного (пептидного) зв’язку між залишками амінокислот. При синтезі пептиду α-карбоксильна група однієї амінокислоти взаємодіє з α-аміногрупою другої амінокислоти, утворюючи пептидний зв’язок із виділенням молекули води:

 

Пептидний зв’язок, що утворюється іміногрупою проліну, відрізняється від інших пептидних зв’язків – у атома азоту пептидної групи відсутній водень, замість нього є зв’язок із радикалом, як наслідок, один бік циклу включається в пептидний каркас:

 

При взаємодії двох амінокислот утворюється дипептид, трьох – трипептид і так далі аж до утворення величезного поліпептиду. Умовно прийнято, що пептиди, які містять від 2 до 20 амінокислотних залишків, належать до олігопептидів; ті, що мають від 20 до 50 амінокислотних залишків, – до поліпептидів. Пептидні ланцюги, які об’єднують понад 50 амінокислот і мають молекулярну масу, більшу за 6000, належать до білків.

Амінокислотні залишки у пептидних ланцюгах різних білків чергуються не випадковим чином, а розташовані в певному порядку. Назви пептидів складаються з назв амінокислот, які входять до їх складу. Амінокислотний залишок, який має вільну α-аміногрупу, називається N-кінцевим, а той, що має вільну α-карбоксильну групу – С-кінцевим. Пептиди записують і читають із N-кінця до С-кінця. Наприклад, у тетрапептиді тир-ліз-глу-про N-кінцевою амінокислотою є тирозин, а С-кінцевою – пролін. Наведемо реакцію утворення цього тетрапептиду:

 

                   

Оскільки до складу пептидів α-амінокислоти входять у формі ацилів, то в назві пептидів вони набувають характерного для ацилів закінчення -іл(-ил) замість ін(-ин), тобто «тирозил» замість «тирозин», «лізил» замість «лізин», «глутаміл» замість «глутамінової кислоти» і т.ін. Найменування пептидів складається з назви першої N-кінцевої амінокислоти із закінченням -іл(-ил), наступних амінокислот із таким самим закінченням і повної назви амінокислоти, яка має вільну            α-карбоксильну групу (С-кінцева амінокислота). Отже, наведений вище тетрапептид має назву тирозил-лізил-глутаміл-пролін. У структурних формулах пептидів амінокислоту з кінцевою α-аміногрупою (N-кінцева амінокислота) пишуть ліворуч, а з кінцевою α-карбоксильною групою (С-кінцева амінокислота) – праворуч.

Первинна структура кожного індивідуального білка закодована в молекулі ДНК і реалізується в ході транскрипції (передача закодованої в ДНК інформації молекулам мРНК) та трансляції (синтезу білка).

Пептидні зв’язки дуже міцні, для їхнього хімічного неферментативного гідролізу використовують жорсткі умови: гідроліз білка проводять у концентрованій сірчаній кислоті при температурі близько 110 °С упродовж 24 годин. У живій клітині пептидні зв’язки можуть розриватися за допомогою протеолітичних ферментів, що мають назву протеази або пептидгідролази.

Із виявлених особливостей у будові пептидного зв’язку       Л. Полінгом і Р. Корі були сформульовані три постулати (принципи формування пептидного зв’язку):

1) атоми, що утворюють пептидний зв’язок, є копланарними (розміщені в одній площині); обертання атомів або груп атомів навколо пептидного зв’язку неможливе;

2) принцип еквівалентності внеску амінокислотних залишків в утворення пептидного зв’язку і тим самим в утворення поліпептидного ланцюга (виняток – пролін);

3) принцип максимуму водневих зв’язків. У білках атоми водню та кисню практично завжди розміщуються у транс-конформації. Це зумовлює можливість утворення в поліпептидному ланцюгу максимуму водневих зв’язків.

Первинну структуру білка стабілізують (підтримують):

-                    пептидні зв’язки (між амінокислотними залишками);

-                    дисульфідні зв’язки (між вільними –SH-групами цистеїну).

Первинна структура білка несе інформацію про його просторову структуру.

Вторинна структура білків – локальна конформація, зумовлена обертанням окремих ділянок поліпептидного ланцюга навколо одинарних ковалентних зв’язків.

Основні зв’язки, які стабілізують вторинну структуру, – водневі зв’язки між атомами пептидних груп амінокислот у складі одного й того самого пептидного ланцюга або між різними пептидними ланцюгами.

Види вторинної структури:

·                                     α-спіраль (правозакручена)

В α-спіралі водневі зв’язки утворюються між атомом кисню карбонільної групи і воднем амідного азоту 4-ї від нього амінокислоти. Водневі зв’язки розташовані паралельно осі спіралі і повторюються багато разів, тому міцно утримують спіралеподібну структуру у дещо напруженому стані (як стиснуту пружину). Бічні радикали амінокислотних залишків розміщуються по периферії спіралі й не беруть участі в утворенні вторинної структури. α-спіраль має певні характеристики: ширину, відстань між двома витками спіралі. Крок спіралі (один повний виток) 5,4Å (0,54 нм) становлять    3,6 амінокислотних залишків на виток, а на один амінокислотний залишок припадає 0,15 нм. Кут підіймання спіралі 26°, через 5 витків спіралі (18 амінокислотних залишків) структурна конфігурація поліпептидного ланцюга повторюється. Це означає, що період повторюваності (або ідентичності) α-спіральної структури становить 2,7 нм.

 

Рисунок 2 – Структура та параметри α-спіралі

Білок не може мати в ланцюгу 100 % α-спіралей і зберігати глобулярність. Він у цьому випадку буде фібрилярним. Більш того, якщо є α-спіраль, вона знаходиться, як правило, в одній, двох або декількох окремих ділянках ланцюга.

Порушення спіральної структури може бути спричинене багатьма факторами. Наприклад, наявністю залишку проліну, циклічна структура якого вносить перегин у пептидний ланцюг; наявністю локального електростатичного відштовхування, зумовленого кластером позитивно заряджених R-груп лізину й аргініну, або кластером негативно заряджених R-груп глутамінової й аспарагінової кислот та іншими причинами. Неспіральна частина пептидного ланцюга може мати структуру складчастого листа або статистичного клубка.

·        β-структура формується між лінійними ділянками пептидного каркасу одного поліпептидного ланцюга, утворюючи при цьому складчасті структури. Стабілізується      β-структура водневими зв’язками між С=О та NH-групами. Поліпептидні ланцюги або їхні частини можуть формувати паралельні або антипаралельні β-структури. У паралельному складчастому листі обидва пептидні ланцюги або дві різні ділянки одного й того самого пептидного ланцюга мають у просторі однаковий напрям (збігаються N- і С-кінці пептидних ланцюгів). В антипаралельному складчастому листі ланцюги спрямовані у протилежні боки (N- і С-кінці пептидних ланцюгів мають протилежний напрям). У деяких білків β-структури можуть формуватися за рахунок утворення водневих зв’язків між атомами пептидного каркасу різних поліпептидних ланцюгів. У природних білках і пептидах трапляються обидві структури, але антипаралельна є більш стабільною,тому і більш поширеною.

 

Рисунок 3 – Паралельні (А) та антипаралельні (Б)

β-складчасті структури

β-структури позначені широкими стрілками

 

Складчасті структури трапляються досить часто.                   β-конформацію мають білки β-кератини. Найбільш характерний приклад – β-фіброїн шовку, який має структуру антипаралельного складчастого листа. Ділянки молекули фіброїну мають структурний фрагмент, що повторюється: Глі-Ала-Глі-Сер-Глі-Ала. При утворенні β-антипаралельної структури R-групи Ала і Сер розміщуються по один бік, а Глі – по інший.

Декілька ділянок поліпептидного ланцюга, що організовані в просторі у формі α-спіралі чи β-структури, можуть об’єднуватися, формуючи надвторинну структуру. В результаті в молекулі білка утворюються домени (функціональні або структурні). За своєю структурою кожний домен нагадує окремий невеликий білок. Як правило, в одному домені міститься від 40 до 300 амінокислотних залишків. Доменом називається ділянка білкової молекули, що має глобулярну форму та утворена декількома вторинними або надвторинними структурами. У різних білках домени можуть бути однаково організованими ділянками і виконувати однакові функції. Вони часто мають специфічні функції, такі, як зв’язування невеликих молекул. У ряді випадків чітко визначити функції тих чи інших доменів не вдається. Між доменами в межах одного й того самого поліпептидного ланцюга встановлюються гідрофобні контакти.

		Рисунок 4 – Доменна організація імуноглобуліну G
	Цікаво У 1954 році за розвиток теорії хімічного зв’язку та застосування її до структури білка Л. Полінг був нагороджений Нобелівською премією. У своїй Нобелівській лекції вчений передбачив, що майбутні хіміки будуть “спиратися на нову структурну хімію, у т. ч. на точно визначені геометричні взаємовідносини між атомами в молекулах і суворе застосування нових структуральних принципів, і що завдяки цій технології буде досягнуто значного прогресу у вирішенні проблем біології і медицини за допомогою хімічних методів”. У 1962 році Л. Полінг був удостоєний Нобелівської премії миру.

 

Третинна структура білків – це тривимірна просторова структура, що утворюється за рахунок взаємодій між радикалами амінокислот, які можуть розташовуватися на значній відстані один від одного в поліпептидному ланцюзі. Зв’язки, що беруть участь у формуванні третинної структури білків:

1) гідрофобні взаємодії. При укладанні поліпептидний ланцюг білка прагне набрати енергетично вигідної форми, що характеризується мінімумом вільної енергії. Тому гідрофобні радикали амінокислот прагнуть до об’єднання усередині глобулярної структури розчинних у воді білків. Між ними виникають так звані гідрофобні взаємодії, а також сили Ван дер Ваальса між близько прилеглими один до одного атомами. У результаті всередині білкової глобули формується гідрофобне ядро;

2) іонні зв’язки. Іонні зв’язки можуть виникати між негативно зарядженими (аніонними) карбоксильними групами радикалів аспарагінової і глутамінової кислот і позитивно зарядженими (катіонними) групами радикалів лізину, аргініну або гістидину;

3) водневі зв’язки. Гідрофільні радикали амінокислот прагнуть утворити водневі зв’язки з водою і тому в основному розміщуються на поверхні білкової молекули. Усі гідрофільні групи радикалів амінокислот, що опинилися всередині гідрофобного ядра, взаємодіють один з одним за допомогою іонних і водневих зв’язків. Водневі зв’язки виникають між гідрофільними незарядженими групами (такими, як -ОН, -CONH₂, SH-групи) і будь-якими іншими гідрофільними групами. Білки, що функціонують у неполярному (ліпідному) оточенні, наприклад, білки мембран, мають іншу будову: гідрофільні радикали амінокислот розташовані всередині білка, в той час як гідрофобні амінокислоти локалізовані на поверхні молекули і контактують із неполярним оточенням. У кожному випадку радикали амінокислот займають найбільш вигідне біоенергетичне положення.

 

Рисунок 5 – Зв’язки, що стабілізують третинну структуру білкової молекули:

·      електростатичні взаємодії (виникають між протилежно зарядженими радикалами) (1);

·      водневі зв’язки (2);

·      гідрофобні взаємодії (виникають між амінокислотними радикалами, що мають неполярну структуру) (3);

·      дисульфідні зв’язки – єдиний тип ковалентних зв’язків, що стабілізують третинну структуру (виникають між наближеними в просторі радикалами цистеїну) (4)

У білка, що має третинну структуру, на поверхні молекули формується ділянка, яка може приєднувати до себе інші молекули, що називаються лігандами. Ця ділянка називається активним центром і формується із радикалів амінокислот, які наближаються один до одного при формуванні третинної структури. Висока специфічність взаємодії білка із лігандом забезпечується комплементарністю структури активного центру до структури ліганду.

Четвертинна структура формується при об’єднанні кількох поліпептидних ланцюгів, що мають третинну структуру. Утворений таким чином білок має нову функцію. Білки з четвертинною структурою називаються олігомерними, а індивідуальні поліпептидні ланцюги, що їх утворюють, – протомерами або мономерами. Такі об’єднання протомерів стабілізуються слабкими нековалентними зв’язками (водневими, гідрофобними, електростатичними взаємодіями) між амінокислотними залишками, розташованими на поверхні протомерів.

Переваги білків із четвертинною структурою:

1) економія генетичного матеріалу;

2) зменшення кількості помилок при синтезі білка;

3) якісна різноманітність білків – поява у білків нових функцій.

Прикладом білка із четвертинною структурою є гемоглобін. Його молекула побудована із чотирьох попарно однакових субодиниць – двох α- та двох β-поліпептидних ланцюгів, кожен з яких з’єднаний із небілковою сполукою гемом – порфіриновим похідним, що зв’язує молекулу кисню.

До складу олігомерних білків може входити від двох до декількох десятків протомерів, хоча найбільш часто трапляються білки, що містять від двох до чотирьох поліпептидних ланцюгів (димерні, тетрамерні білки). Так, фермент гексокіназа містить у своєму складі 2 протомери; фермент лактатдегідрогеназа – 4 протомери; фермент внутрішньої мембрани мітохондрій цитохромоксидаза –            13 протомерів, а глутамінсинтетаза - 12 протомерів. Є також великі багатофункціональні комплекси, що містять у своєму складі декілька десятків поліпептидних ланцюгів, наприклад, піруватдегідрогеназний комплекс складається із 312 протомерів.

Деякі олігомерні білки містять ідентичні протомери (наприклад, гексокіназа), інші складаються з різних протомерів. Так, у складі лактатдегідрогенази, що містить 4 протомери, є два типи мономерів (Н і М), які у різних тканинах можуть перебувати в різних комбінаціях (НННН, НННМ, ННММ, НМММ, ММММ).

5. Природні пептиди: класифікація, біохімічна характеристика

В організмі людини виробляється безліч пептидів, що беруть участь у регуляції різних біологічних процесів і мають високу фізіологічну активність. Кількість амінокислотних залишків у структурі біологічно активних пептидів може варіювати від 3 до 50. До найменшого розміру пептидів можна віднести тиреотропін-рилізинг-гормон і глутатіон (трипептиди), а також енкефаліни, що мають у своєму складі 5 амінокислот. Однак більшість біологічно активних пептидів має у своєму складі більше 10 амінокислот, наприклад, нейропептид Y (регулятор апетиту) містить 36 амінокислот, а кортиколіберин – 41 амінокислоту.

Як правило, пептидні гормони синтезуються з неактивних білкових попередників, в яких специфічні протеолітичні ферменти руйнують певні пептидні зв’язки. Ангіотензин II – октапептид, що утворюється з великого білка плазми крові ангіотензиногену в результаті послідовної дії двох протеолітичних ферментів. Перший протеолітичний фермент ренін відщеплює з N-кінця ангіотензиногену пептид, що містить 10 амінокислот – ангіотензин I. Другий протеолітичний фермент карбоксидипептидилпептидаза відщеплює від С-кінця ангіотензину I дві амінокислоти, в результаті чого утворюється біологічно активний ангіотензин II, який бере участь у регуляції артеріального тиску і водно-сольового обміну в організмі.

 

Проте у деяких біологічно активних пептидах можуть міститися зв’язки між амінокислотами, що не трапляються в білках. Наприклад, у трипептиді глутатіоні, що побудований із глутамату, цистеїну і гліцину, N-кінцева амінокислота глутамат зв’язана із другою амінокислотою цистеїном не через свою       α-карбоксильну групу, а через γ-карбоксильну групу свого бічного радикала.

Глутатіон – значно поширений пептид організму людини. Він може бути використаний в окисно-відновних реакціях як донор і акцептор водню і необхідний для роботи низки ферментів.

Функції пептидів залежать від їх первинної структури. Ангіотензин I за структурою дуже схожий на ангіотензин II (має тільки дві додаткові амінокислоти з С-кінця), але при цьому не має біологічної активності. Зміна в амінокислотному складі пептидів часто призводить до втрати одних і появи інших біологічних властивостей. Як приклад можна розглянути структуру і властивості двох пептидних гормонів – окситоцину і вазопресину. У гіпоталамусі окситоцин і вазопресин утворюються в результаті часткового (обмеженого) протеолізу білкових попередників більшого розміру. Із гіпоталамуса по нервових волокнах ці гормони всередині секреторних гранул переміщаються в нервові закінчення аксонів, що знаходяться в задній частці гіпофіза. Після дії специфічних стимулів ці гормони виділяються в кров. Окситоцин і вазопресин у своїй структурі мають багато спільного: обидва містять по                   9 амінокислотних залишків; 7 амінокислотних залишків із          9 ідентичні; 2 залишки цистеїну з’єднані дисульфідним зв’язком; на С-кінці пептидів α-карбоксильна група глутамату амідована. Незважаючи на невеликі відмінності в послідовності амінокислот (заміни амінокислот у положеннях 3 і 8), ці гормони сильно відрізняються за фізіологічною дією. Так, окситоцин виділяється в кров під час годування дитини, викликає скорочення міоепітеліальних клітин проток молочних залоз і стимулює виділення молока. Крім того, окситоцин впливає на гладку мускулатуру матки під час пологів, викликаючи її скорочення. На відміну від окситоцину, основна фізіологічна дія вазопресину – збільшення реабсорбції води в нирках при зменшенні артеріального тиску або об’єму крові (тому інша назва цього гормону – антидіуретичний). Крім того, вазопресин викликає вазоконстрикторну дію.

 

Оскільки пептиди – потужні регулятори біологічних процесів, їх можна використовувати як лікарські препарати. Основна перешкода для терапевтичного використання – їх швидке руйнування в організмі. Одним із найважливіших результатів досліджень є не тільки вивчення структури пептидів, але й одержання синтетичних аналогів природних пептидів із цілеспрямованими змінами в їх структурі та функціях. Наприклад, синтезований пептид 1-дезаміно-8-D-аргінін-вазопресин (ДАВ). У структурі цього пептиду (порівняно із вазопресином) немає аміногрупи на N-кінці, і замість L-аргініну в положенні 8 стоїть D-аргінін. Такий синтетичний пептид має тільки антидіуретичну активність і хімічно стійкий, тобто при введенні в організм викликає тривалу реакцію. Такий штучний аналог гормону (порівняно із природним) більш ефективний при лікуванні гормональної недостатності.

Відкриті та вивчені на даний час пептиди можна класифікувати на групи за їх основною фізіологічною дією:

·      пептиди, що мають гормональну активність (окситоцин, вазопресин, рилізинг-гормони гіпоталамуса, меланоцитстимулювальний гормон, глюкагон та ін.);

·      пептиди, що регулюють процеси травлення (гастрин, холецистокінін, вазоінтестинальний пептид та ін.);

·      пептиди, що регулюють тонус судин і артеріальний тиск (брадикінін, калідин, ангіотензин ІІ);

·      пептиди, що регулюють апетит (лептин, нейропептид Y, меланоцитстимулювальний гормон, β-ендорфіни);

·      пептиди, що мають знеболювальний ефект (енкефаліни   та ендорфіни та інші опіоїдні пептиди). Знеболювальний ефект цих пептидів у сотні разів перевищує аналгезуючий ефект морфіну;

·      пептиди, що беруть участь у регуляції вищої нервової діяльності, в біохімічних процесах, пов’язаних із механізмами сну, навчання, пам’яті, виникнення почуття страху і т.д.;

·      пептиди-антиоксиданти (глутатіон).

Однак такий розподіл пептидів дуже умовний. З’явилися дані про те, що багато пептидів мають широкий спектр дії. Так, меланоцитстимулювальний гормон, крім стимуляції пігментоутворення, бере участь у регуляції апетиту (разом із лептином пригнічує споживання їжі і є антагоністом нейропептиду Y). У той самий час β-ендорфіни, крім анальгезуючого ефекту, є синергістами нейропептиду Y, тобто посилюють апетит. Вазопресин, крім антидіуретичної та судинозвужувальної дії, має властивість покращувати пам’ять.

6. Сучасні класифікації білків. Загальна характеристика окремих класів білків, їх роль

I Функціональна (за функцією, що білки виконують в організмі) – виділяють каталітичні, скоротливі, структурні, транспортні, захисні, регуляторні, рецепторні білки.

II За формою молекули

1. Глобулярні білки являють собою компактні сферичні молекули, водорозчинні (відношення довжини молекули до діаметра не перевищує 4); глобулярні білки виконують динамічні функції (ферменти, імуноглобуліни і транспортні білки гемоглобін і альбумін).

2. Фібрилярні білки мають паличкоподібну витягнуту форму, нерозчинні в воді (відношення довжини молекули до діаметра більше 10); вони виконують в основному структурні і захисні функції (наприклад, колаген).

III За ступенем складності молекули

1. Прості білки (складаються лише з амінокислот).

2. Складні білки (складаються з простого білка, зв’язаного із небілковим компонентом). Небілкова частина називається простетичною групою. Білок без простетичної групи називається апопротеїном. Білкова частина із простетичною групою називається холопротеїном. Простетична група відіграє ключову роль у функціонуванні білка.

Класифікація простих білків базується на розчинності. До простих білків належать:

1)      альбумін – білок, який добре розчиняється у воді та добре висолюється з водних розчинів. Цей білок має некомпенсований від’ємний заряд і кислі властивості (ізоелектрична точка – 4,7). Альбумін відіграє основну роль у формуванні онкотичного тиску плазми, приєднує і транспортує жирні кислоти, холестерол, білірубін, вітаміни, гормони, фенол та інші токсичні і лікарські сполуки;

2)      глобуліни – білки, розчинні у слабких сольових розчинах. Як правило, для їх екстракції застосовують 10 % розчин NaCl. Це слабкокислі або нейтральні білки (ізоелектрична точка лежить у межах рН 6–7,3), які містять менше, ніж альбуміни, кислих амінокислот. Глобуліни виконують різноманітні функції в організмі. Деякі з них транспортують мінеральні речовини (мідь, залізо та ін.), гормони, жирні кислоти, вітаміни; інші є антипротеазами;

3)      протаміни – це білки невеликої молекулярної маси, що складаються на 80 % із основних амінокислот (аргініну) і не містять сірки. Ці білки знаходяться переважно у сперміях. За величиною молекул протаміни – білки найменшого розміру. Деякі з них навіть складаються із семи амінокислот, серед яких аргінін, пролін і серин становлять більше половини молекули;

4)      гістони – низькомолекулярні білки, містяться у хромосомах клітинних ядер і відіграють важливу роль в утворенні структури хроматину. Гістони – справжні білки, до їх складу входять майже всі білкові амінокислоти. Вони характеризуються високим вмістом основних амінокислот: аргінін (до 26 %), лізин (8-10 %). Ізоелектрична точка різних гістонів знаходиться в межах рН 9,5–12,0. Залежно від співвідношення аргініну і лізину розрізняють 5 типів гістонів: Н₁, Н_2а, Н_2b, Н₃, Н₄. Гістони міцно зв’язані з ДНК за допомогою електростатичного зв’язку (вони мають позитивний заряд, а ДНК – негативний). У складі нуклеопротеїнів ядра гістони виконують структурну і регуляторну функції: стабілізують просторову структуру ДНК, складають основу нуклеосом. Гістони блокують передачу генетичної інформації від ДНК до РНК (роль репресора), тобто регулюють біосинтез білка;

5)      проламіни – білки, які розчиняються в 60-80 % розчині етилового спирту. Назву “проламіни” вони отримали тому, що до їх складу входить велика кількість амінокислоти проліну. Проламіни синтезуються тільки в насінні злакових рослин. Проламіни пшениці називають гліадин, кукурудзи – зеїн, ячменю – гордеїн;

6)      глютеліни – білки, які виділяють із рослинних тканин розведеними розчинами лугів (0,2 % NаОН). Вони нерозчинні у воді, спирті й розчинах солі. Глютеліни пшениці – це глютенін, рису – орізенін;

7)      склеропротеїни – фібрилярні білки, що входять до складу опорних та покривних тканин – кісток, хрящів, зв’язок, волосся, нігтів, шкіри тощо. Ці білки нерозчинні у воді й сольових розчинах, слабо розчинні у кислотах і лугах. Прикладами склеропротеїнів є колаген, еластин, кератини.

Колаген – основний білок сполучної тканини. Молекула колагену побудована із трьох поліпептидних ланцюгів, у кожному з них міститься приблизно 1000 амінокислотних залишків. Кожен ланцюг утворює спіралі, що відрізняються від α-спіралі. Молекула колагену побудована на 30 % із амінокислоти гліцину, на 20 % – із проліну та гідроксипроліну, на 10 % – з аланіну та на 40 % – з інших амінокислот.

Інший білок сполучної тканини – еластин – відрізняється від колагену структурою і властивостями: хімічно він активніший, частково перетравлюється травними ферментами, має еластичні властивості.

Кератини – фібрилярні білки епідермісу шкіри, волосся, нігтів. До їх складу входить багато сірковмісних амінокислот (цистеїн, цистин) і тирозину. Молекули кератину з’єднуються між собою дисульфідними зв’язками, що надає міцності й жорсткості всій структурі. Поліпептидні ланцюги кератинів утворюють α-спіраль. Об’єднання трьох таких ланцюгів, закручених у суперспіраль, утворює протофібрилу. Спіральний джгут із декількох протофібрил утворює мікрофібрилу, а з декількох мікрофібрил – макрофібрилу.

Класифікація складних білків базується на будові простетичної групи. До складних білків належать:

1) хромопротеїни – білки, які мають забарвлену простетичну групу.

Простетична група хромопротеїнів зв’язується із гістидином поліпептидного ланцюга за допомогою координаційних зв’язків. У свою чергу, хромопротеїни поділяють на:

·      гемопротеїни (гемоглобін, міоглобін, цитохроми, каталаза, пероксидаза). Простетичною групою цих білків є гем. Гем – молекула, що має структуру циклічного тетрапіролу, де              4 пірольних кільця з’єднані між собою метиленовими містками та містять 4 метильні групи, 2 вінільні групи та 2 залишки пропіонової кислоти у бокових ланцюгах. Ця органічна частина гему називається протопорфірином. У гемі 4 атоми азоту пірольних кілець протопорфірину зв’язані чотирма координаційними зв’язками з Fe2+, що знаходиться в центрі молекули;

гемоглобін як білковий компонент містить глобін, а небілковий – гем. Видові відмінності гемоглобіну обумовлені глобіном, у той час як гем однаковий у всіх видів гемоглобіну. Гемоглобін траспортує кисень від легенів до тканин і діоксид вуглецю – від тканин до легень. У молекулі гемоглобіну дорослої людини HbА₁ (від англ. аdult - дорослий) містяться чотири поліпептидні ланцюги, які разом складають білкову частину молекули – глобін. Два з них, що називаються               α-ланцюгами, мають однакову первинну структуру і складаються із 141 амінокислотного залишку. Два інші, що позначаються β-ланцюгами, також ідентично побудовані і містять по 146 амінокислотних залишків. Таким чином, уся молекула білкової частини гемоглобіну складається із             574 амінокислот.

Окрім HbA₁, у крові дорослої людини міститься гемоглобін НbА₂, який складається із 4 субодиниць: двох α-ланцюгів і двох δ-ланцюгів. На частку НbА₂ припадає близько 2,5 % від усього гемоглобіну. Відомий, крім того, фетальний гемоглобін (гемоглобін новонароджених), що позначається HbF та складається із двох α-ланцюгів і двох γ-ланцюгів. Фетальний гемоглобін відрізняється від HbA₁ не тільки складом амінокислот, але й фізико-хімічними властивостями: спектральним показником, електрофоретичною рухливістю, стійкістю до лужної денатурації та ін. Кров новонароджених містить до 80 % HbF, але до кінця 1-го року життя він майже цілком замінюється на НbА (все ж у крові дорослої людини міститься до 1,5 % HbF від загальної кількості гемоглобіну).

Сполука гемоглобіну з киснем називається оксигемоглобіном (HbO₂). Сполука гемоглобіну із чадним газом називається карбоксигемоглобіном (HbСO). Сполука гемоглобіну із вуглекислим газом називається карбгемоглобіном (HbСO₂). Під впливом окисників гемоглобін перетворюється в метгемоглобін, що містить тривалентне залізо;

міоглобін – білок м’язів, що містить гем і глобін. На відміну від гемоглобіну, міоглобін – мономер, його глобінова частина представлена одним поліпептидним ланцюгом. Міоглобін у       5 разів швидше зв’язує кисень, ніж гемоглобін. Завдяки цьому міоглобін створює запас кисню і забезпечує дихання м’язів до надходження кисню із гемоглобіном крові. Подібно до гемоглобіну міоглобін здатний утворювати похідні з киснем, оксидом вуглецю, ціанідами.

Цитохроми – білки мітохондрій і ендоплазматичної сітки. Вони транспортують електрони по дихальному ланцюгу і таким чином беруть участь в окисно-відновних процесах, що спрямовані на вироблення енергії в дихальному ланцюгу мітохондрій або знешкодження токсичних речовин в ендоплазматичній сітці.

Ферменти каталаза і пероксидаза виконують антиоксидантну функцію в організмі.

·      флавопротеїни. Флавопротеїни містять міцно зв’язані з білком простетичні групи, представлені ізоалоксазиновими похідними – окисненими флавінмононуклеотидом (ФМН) і флавінаденіндинуклеотидом (ФАД). Наявність коферментних форм вітаміну B₂ надає флавопротеїнам жовтого кольору. Флавопротеїни входять до складу оксидоредуктаз – ферментів, які каталізують окиснювально-відновні реакції в клітині. Деякі флавопротеїни містять іони металів. Типовими представниками флавопротеїнів, що містять також негемове залізо, є ксантин-оксидаза, альдегідоксидаза, дигідрооротатдегідрогеназа, ацил-КоА-дегідрогеназа і флавопротеїн, який транспортує електрони. На частку двох останніх припадає до 80 % мітохондріальних флавопротеїнів, що виконують важливу роль у біоенергетиці клітини. Негемове залізо зв’язується з білковим компонентом, що відрізняється від гемовмісних хромопротеїнів. Залізо ковалентно зв’язане з атомом сірки залишку цистеїну білка. При кислотному гідролізі такого білка вивільняються залізо і H₂S. Незважаючи на структурні відмінності від цитохромів, негемові флавопротеїни виконують аналогічну функцію в транспорті електронів завдяки здатності переходити з окисненого у відновлений стан;

2) глікопротеїни – білки, простетична група яких містить вуглеводи (глюкозу, галактозу, манозу та ін.) або їх похідні (глюкозаміни, галактозаміни та ін.). Вуглеводна частина глікопротеїнів може бути представлена моно- або полісахаридом. Вуглевод з’єднується з білковою частиною ковалентними зв’язками. У зв’язуванні з вуглеводом бере участь OH-група амінокислоти серину або треоніну. Цим білкам належить важлива роль у структурній організації клітин і тканин, вони забезпечують клітинну адгезію, молекулярне і клітинне розпізнавання, антигенну активність пухлинних клітин, виявляють захисну, гормональну, а також антивірусну дію; ряд ферментів і гормонів за природою є глікопротеїнами.

Усі глікопротеїни поділяються на дві групи:

·      власне глікопротеїни;

·      протеоглікани.

Власне глікопротеїни – це типові білки. Вміст вуглеводних компонентів у них – до 4 %. Протеоглікани (стара назва “мукопротеїни”) містять до 90 % і більше вуглеводів. В їх складі містяться глікозаміноглікани або кислі мукополісахариди, які є характерними для сполучної тканини. Прикладами глікопротеїнів є α₁-, α₂-глобуліни, резус-антитіла, муцини. Глікопротеїни шлунково-кишкового тракту муцини – основа різних слизів, вони виконують захисну функцію, послаблюючи механічне та хімічне подразнення клітин травного тракту. Мукоїди – протеоглікани синовіальних рідин у суглобах і хрящах, що відіграють роль змащувальних матеріалів. Їх простетичною групою є гіалуронова та хондроїтинсірчана кислоти. Протеоглікан гепарин виконує антикоагулянтну функцію. Рецептори плазматичних мембран за своєю природою є глікопротеїнами;

3) ліпопротеїни – білки, простетична група яких містить ліпіди (триацилгліцероли, жирні кислоти, фосфоліпіди, холестерол). Умовно ліпопротеїни можна поділити на рухомі (ліпопротеїни плазми крові, молока та ін.) та фіксовані або структурні (містяться в складі мембран). Перші є водорозчинними, а другі – жиророзчинними. Зв’язки між білковою частиною молекули і ліпідом – гідрофобні або іонні.

Ліпопротеїни плазми крові являють собою міцели, в центрі яких знаходяться триацилгліцероли та ефіри холестеролу, а зовнішній шар утворений фосфоліпідами, неетерифікованим холестеролом та білками. За рахунок такої будови ліпопротеїни розчиняються у плазмі крові й забезпечують транспорт ліпідів до органів. Розрізняють хіломікрони, α-ліпопротеїни (ліпопротеїни високої щільності, ЛПВЩ), β-ліпопротеїни (ліпопротеїни низької щільності, ЛПНЩ), пре-β-ліпопротеїни (ліпопротеїни дуже низької щільності, ЛПДНЩ). Кожен із них відповідає за транспортування певних видів ліпідів: хіломікрони транспортують екзогенні триацилгліцероли від кишечника до тканин, ЛПДНЩ транспортують ендогенні триацилгліцероли від печінки до тканин, ЛПНЩ здійснюють транспорт холестеролу до периферійних тканин (атерогенні), ЛПВЩ здійснюють транспорт холестеролу з периферійних тканин до печінки (антиатерогенні).

Структурні ліпопротеїни є компонентами біологічних мембран. Вони містять більше білків (до 65-85 %) і розчиняються у жиророзчинниках. У цих ліпопротеїнах білки утворюють серцевину, а оболонку утворюють полярні ліпіди;

4) металопротеїни – білки, простетична група яких представлена іоном якогось одного металу або декількох металів. Вони транспортують або беруть участь у депонуванні металів. До таких білків належать, наприклад, білки, що містять негемове залізо, а також білки, що координаційно зв’язані з атомами металів у складі складних білків-ферментів. Типовими представниками перших є залізовмісні білки феритин, трансферин і гемосидерин. Феритин – високомолекулярний водорозчинний білок із молекулярною масою 400000, в якому вміст заліза становить від 17 до 23 % (у середньому 20 %). Він зосереджений головним чином у селезінці, печінці, кістковому мозку, виконуючи роль депо заліза в організмі. Залізо у феритині знаходиться в окисненій формі. Трансферин – розчинний у воді залізопротеїн (молекулярна маса 90000), глікопротеїн, виявляється головним чином у сироватці крові у складі β-глобулінів. Вміст заліза в ньому становить 0,13 %. Припускають, що атом заліза з’єднується з білком координаційними зв’язками за участі гідроксильних груп тирозину. Молекула трансферину містить 2 атоми заліза; трансферин служить фізіологічним транспортером заліза в організмі. Гемосидерин на відміну від феритину і трансферину є водонерозчинним залізовмісним білковим комплексом, що складається, крім того, на 25 % із нуклеотидів і вуглеводів. Він міститься головним чином у ретикулоендотеліоцитах печінки і селезінки. Біологічна роль гемосидерину вивчена недостатньо. До другої групи металопротеїнів належить ряд ферментів: ферменти, що містять зв’язані з молекулою білка іони металів, що визначають їх функцію, – металоферменти (у процесі очищення метали залишаються зв’язаними із ферментами); ферменти, що активуються іонами металів, менш міцно зв’язані з металами, але для прояву своєї активності потребують додавання до реакційного середовища певного металу. Припускають, що механізми участі металу в акті каталізу в обох випадках, найімовірніше, подібні; іони металу беруть участь в утворенні потрійного комплексу: активний центр ферменту-метал-субстрат (Е-М-S) або М-Е-S, або Е-S-М. Є докази, що в активному центрі багатьох ферментів у зв’язуванні металу бере участь імідазольна група гістидину;

5) нуклеопротеїни – білки, простетичною групою яких є нуклеїнова кислота. Розрізняють дезоксирибонуклеопротеїни (простетична група – ДНК) і рибонуклеопротеїни (простетична група – РНК). Їм належить важлива роль у зберіганні, передачі і реалізації генетичної інформації. Між білком і молекулою нуклеїнової кислоти утворюються іонні зв’язки. Білкова частина нуклеопротеїнів у людини та високоорганізованих тварин представлена переважно гістонами і протамінами. Тому за білковими частинами нуклеопротеїни поділяють на нуклеогістони та нуклеопротаміни. Дезоксирибонуклеопротеїни є надмолекулярними комплексами, що формують хроматин, а рибонуклеопротеїни – рибосоми;

6) фосфопротеїни – білки, що містять у своєму складі фосфорну кислоту. Між білком і залишком фосфорної кислоти формуються складноефірні зв’язки, в утворенні яких беруть участь OH-групи серину або треоніну. Ці білки знаходяться в молоці (казеїноген), ікрі риб (іхтулін), жовткові курячого яйця (вітелін, вітеленін, фосфовітин). Фосфорна кислота у фосфопротеїнах, відщеплюючись, може використовуватись організмом для енергетичних і пластичних цілей. Саме тому вони містяться переважно в тих продуктах, які використовуються в ембріогенезі або в постембріональному періоді. Деякі ферменти, наприклад, фосфорилаза, пепсин, за своєю природою є фосфопротеїнами.

7. Фізико-хімічні властивості білків

Індивідуальні білки відрізняються за своїми фізико-хімічними властивостями: формою молекул, молекулярною масою, сумарним зарядом молекули, співвідношенням полярних і неполярних груп на поверхні нативної молекули білка, розчинністю, а також ступенем стійкості до впливу денатуруючих агентів.

1. Відмінності білків за формою молекул. Як уже зазначалося вище, за формою молекул білки класифікують на глобулярні і фібрилярні. Глобулярні білки мають більш компактну структуру, їх гідрофобні радикали заховані в гідрофобне ядро, і вони значно краще розчинні в рідинах організму, ніж фібрилярні білки (виняток становлять мембранні білки).

2. Відмінності білків за молекулярною масою. Білки – високомолекулярні сполуки, але можуть сильно відрізнятися за молекулярною масою, що коливається від 6000 до 1 000 000 Да і вище. Молекулярна маса білка залежить від кількості амінокислотних залишків у поліпептидному ланцюзі, а для олігомерних білків – і від кількості протомерів (або субодиниць), що входять до його складу.

Цікаво Дальтон (Да) і кілодальтон (кДа)– одиниці вимірювання маси білків. 1 дальтон дорівнює 1/12 маси атома вуглецю (12С), або 1,661 10–24 г. Названо на честь англійського фізика та хіміка Дж. Дальтона (1766–1844).

 

3. Сумарний заряд білків. За рахунок електролітичної дисоціації NH₂ і COOH груп білки проявляють властивості амфотерних сполук. Білки мають у своєму складі радикали лізину, аргініну, гістидину, глутамінової та аспарагінової кислот, що містять функціональні групи, здатні до іонізації (іоногенні групи). Крім того, на N- і С-кінцях поліпептидних ланцюгів є α-аміно- і α-карбоксильна групи, також здатні до іонізації. Сумарний заряд білкової молекули залежить від співвідношення іонізованих аніонних радикалів Глу і Асп і катіонних радикалів Ліз, Apr і Гіс. Ступінь іонізації функціональних груп цих радикалів залежить від рН середовища. При рН розчину близько 7 всі іоногенні групи білка знаходяться в іонізованому стані. У кислому середовищі збільшення концентрації протонів (Н⁺) призводить до зменшення дисоціації карбоксильних груп і зменшення негативного заряду білків:

–СОО^- + Н⁺ → –СООН.

У лужному середовищі зв’язування надлишку ОН^- із протонами, що утворюються при дисоціації NH3⁺ з утворенням води, призводить до зменшення позитивного заряду білків:

–NH₃⁺ + ОН^- → –NH₂ + H₂O.

Значення рН, при якому білок набуває сумарний нульовий заряд, називають ізоелектричною точкою білка (pI, ІЕТ). В ізоелектричній точці кількість позитивно і негативно заряджених груп білка однакова, тобто білок знаходиться в ізоелектричному стані. Оскільки більшість білків у клітині має у своєму складі більше аніоногенних груп (–СОО^-), то ІЕТ цих білків лежить у слабокислому середовищі. ІЕТ білків, у складі яких переважають катіоногенні групи, знаходиться в лужному середовищі. Найбільш яскравий приклад таких внутрішньоклітинних білків, що містять багато аргініну і лізину, – гістони, що входять до складу хроматину. Білки, що мають сумарний позитивний або негативний заряд, краще розчинні, ніж білки, що знаходяться в ізоелектричній точці. Сумарний заряд збільшує кількість диполів води, здатних зв’язуватися з білкової молекулою, і перешкоджає контакту однойменно заряджених молекул, у результаті розчинність білків збільшується.

Заряджені білки можуть рухатися в електричному полі: аніонні білки, що мають негативний заряд, будуть рухатися до позитивно зарядженого анода (+), а катіонні білки – до негативно зарядженого катода (–). Білки, що знаходяться в ізоелектричному стані, не переміщаються в електричному полі.

4. Співвідношення полярних і неполярних груп на поверхні нативних молекул білків. На поверхні більшості внутрішньоклітинних білків переважають полярні радикали, однак співвідношення полярних і неполярних груп відрізняється для індивідуальних білків. Так, протомери олігомерних білків в області контактів один з одним часто містять гідрофобні радикали. Поверхні білків, що функціонують у складі мембран або прикріпляються до них у процесі функціонування, також збагачені гідрофобними радикалами. Такі білки краще розчинні в ліпідах, ніж у воді.

5. Розчинність білків. Розчинність білків у воді залежить від усіх перелічених вище властивостей білків: форми, молекулярної маси, величини заряду, співвідношення полярних і неполярних функціональних груп на поверхні білка. Крім того, розчинність білка визначається складом розчинника, тобто наявністю в розчині інших розчинених речовин. Наприклад, деякі білки легше розчиняються в слабкому сольовому розчині, ніж у дистильованій воді. З іншого боку, збільшення концентрації нейтральних солей може сприяти випадінню певних білків в осад (висолювання).

6. Відмінності білків за ступенем стійкості до впливу денатуруючих агентів. Денатуруючі агенти, що наявні в розчині, також знижують розчинність білків. Денатурація – порушення просторової структури білка (втрата вторинної, третинної та четвертинної (якщо вона була) структур зі збереженням первинної структури) та порушення характерних для даного білка фізико-хімічних властивостей. Денатурація супроводжується зниженням або втратою специфічної для даного білка біологічної активності (ферментативної, гормональної тощо). Механізм впливу денатуруючих агентів полягає в руйнуванні слабких зв’язків (водневих, іонних, дипольних, гідрофобних), що стабілізують вторинну, третинну та четвертинну структури білкових молекул. Первинна структура при цьому зберігається, оскільки вона утворена міцними ковалентними зв’язками. Денатурація може бути оборотною (структура білка відновлюється після усунення денатуруючого агента – ренатурація) або необоротною (просторова структура молекули не відновлюється, наприклад, при осадженні білків концентрованими мінеральними кислотами, солями важких металів).

Фактори, що викликають денатурацію білків, можна поділити на фізичні і хімічні.

До фізичних факторів належать:

·      висока температура. Для різних білків характерна різна чутливість до теплового впливу. Частина білків піддається денатурації вже при температурі 40-50 ºС. Такі білки називають термолабільними. Інші білки денатурують при значно вищих температурах, вони є термостабільними;

·      ультрафіолетове опромінення;

·      рентгенівське і радіоактивне опромінення;

·      ультразвук;

·      механічний вплив. Так, наприклад, інтенсивне струшування розчину білка призводить до зіткнення білкових молекул із повітряним середовищем на поверхні поділу фаз та зміни конформації цих молекул.

До хімічних факторів належать:

·      концентровані кислоти і луги. Наприклад, трихлороцтова кислота (органічна), азотна кислота (неорганічна);

·      солі важких металів (наприклад, CuSO₄);

·      органічні розчинники (етиловий спирт, ацетон);

·      рослинні алкалоїди;

·      сечовина у високих концентраціях;

·      інші речовини, здатні порушувати слабкі типи зв’язків у молекулах білків.

Вплив денатуруючих факторів застосовують для стерилізації обладнання та інструментів, а також як антисептики.

Цікаво In vivo в організмі можлива ренатурація білків. Це пов’язано з продукцією у живому організмі специфічних білків, які “розпізнають” структуру денатурованого білка, приєднуються до нього за допомогою слабких типів зв’язку і створюють оптимальні умови для ренатурації. Такі специфічні білки відомі як “шаперони” (із французької shaperon – няня). Ці білки є в усіх клітинах організму. Вони виконують також функцію траспорту поліпептидних ланцюгів через біологічні мембрани і беруть участь у формуванні третинної і четвертинної структур білкових молекул. Шаперони, що беруть участь у захисті клітинних білків від денатуруючих впливів, відомі як “білки теплового шоку” або “білки стресу” і в літературі їх позначають як HSP (від англійської heat shock protein). При дії різних стресових факторів відбувається індукція синтезу таких білків: при перегріві організму (40–    44 ºС), гіпоксії, вірусних захворюваннях, дії ультрафіолетового опромінення, отруєннях. В організмі південних народів виявлено підвищений вміст білків стресу порівняно із північною расою. Встановлено, що короткотривалі стресові впливи збільшують вироблення білків теплового шоку і підвищують стійкість організму до тривалих стресових впливів. Так, короткотривала ішемія серцевого м’яза в період бігу при помірних тренуваннях значно підвищує стійкість міокарда до тривалої ішемії, викликаної стенокардією або закупорюванням судин серця тромбом. На сьогодні перспективними дослідженнями в медицині є пошуки фармакологічних і молекулярно-біологічних способів активації синтезу білків теплового шоку в клітинах.

 

8. Етапи дослідження первинної структури білків і пептидів

Для вивчення будови і властивостей білків необхідним є їх виділення з клітини та очищення від інших білків та органічних молекул.

Основними етапами дослідження первинної структури білків і пептидів є:

I Виділення білка із суміші в чистому вигляді (за однією з ознак: розмір молекули, заряд, специфічна спорідненість зв’язування). Визначення молекулярної маси.

II Визначення N-кінцевої амінокислоти.

III Визначення С-кінцевої амінокислоти.

IV Визначення амінокислотної послідовності білкового ланцюга.

8.1. Методи виділення білків із біооб’єктів

Виділення білка з біологічного матеріалу ґрунтується на його фізико-хімічних властивостях. Найчастіше для цих цілей використовують кислотно-основні властивості білків (амфотерність, заряд молекули, ізоелектричний стан).

Від заряду білкових молекул залежить їх:

·      розчинність (мінімальна в ІЕТ);

·      електрофоретична рухливість;

·      структура і біологічна активність.

При розчиненні у водному середовищі на поверхні білкової молекули формується гідратна оболонка.

        Стійкість білка в розчині залежить від:

1) заряду білкової молекули;

2) наявності гідратної оболонки;

3) молекулярної маси білка.

Для виділення нативних білків (без зміни просторової структури) із біологічного розчину використовують методи:

·      висолювання – осадження білків солями лужних і лужноземельних металів ((NH₄)₂SO₄, NH₄Cl, KCl, NaCl, Na₂SO₄, MgSO₄ та ін.). Висолювання зумовлюється дегідратацією макромолекул білка з одночасною нейтралізацією зарядів протилежно зарядженими іонами солі. Різні білки висолюються при різному насиченні нейтральними солями і різних значеннях рН розчину, що залежить від різниці в молекулярній масі, міри дисперсності білка, іонної сили осаджувача. Білки з найменшою розчинністю випадають в осад при невеликих концентраціях солей. При цьому первинна структура білка не порушується. Це грубий метод розділення білків на групи. Так, глобуліни, які мають більшу молекулярну масу порівняно з альбумінами, випадають в осад при напівнасиченні, а альбуміни – при повному насиченні розчину сульфатом амонію;

·      органічні розчинники при низьких температурах використовуються для щадного групового розділення білків. Так, за методом Кона фракціонують білки плазми крові спиртом: альбумін – спирт 40 %, рН 4,8, 1-5 °С; α₁-глобуліни – спирт 18 %, рН 5,2, 1-5 °С; α₂-глобуліни – спирт 40 %, рН 5,8, 1-5 °С; β, γ-глобуліни – спирт 25 %, рН 6,9, 1-5 °С; фібриноген – спирт 8 %, рН 7,2, 1-3 °С.

        При використанні цих методів білки позбавляються гідратної оболонки і випадають в осад.

       

8.2. Методи фракціонування білків

8.2.1. Відділення білків від низькомолекулярних домішок Діаліз (метод мембранних сит) базується на нездатності білків проходити через напівпроникну мембрану на відміну від низькомолекулярних речовин. Використовують діалізну мембрану, яка є полімером і має пори певної величини. Малі молекули (низькомолекулярні домішки) проходять через пори в мембрані, а крупні (білки) затримуються. Таким чином білки відмивають від низькомолекулярних домішок, наприклад, від солей після висолювання.

8.2.2. Розділення білків за молекулярною масою. Гель-фільтрація (гель-хроматографія). Гель-фільтрацію проводять на хроматографічних колонках, заповнених гранулами набряклого гелю (сефадекс), який являє собою полісахаридні ланцюги декстрану та має пори певного діаметра. Залежно від розмірів пор випускають ряд марок сефадексів: G-200, G-100, G-75 та ін. У колонку вносять суміш білків. Швидкість проходження білків через колонку, заповнену сефадексом, буде залежати від їхньої молекулярної маси: чим менша маса молекул білка, тим легше вони проникають всередину гранул сефадексу й довше там затримуються. Білки ж із більшою молекулярною масою не проникають через пори у гранули гелю, а тому вони швидше виходять із колонки разом із розчинником, що знаходиться між гранулами. Оскільки ступінь дифузії у гранули гелю залежить від розмірів молекул, то елюція речовин із колонки відбувається в порядку зменшення їх молекулярної маси. Молекулярну масу досліджуваного білка визначають шляхом порівняння його об’єму елюювання з аналогічним параметром для білків-маркерів.

 

Рисунок 6 – Схема розділення білків методом

гель-фільтрації

Ультрацентрифугування. Цей метод базується на різній швидкості седиментації (осадження) білкових молекул у розчині хімічно інертної речовини (сахарози або хлориду цезію). Для покращання роздільної здатності ультрацентрифуги використовують розчин із різним градієнтом густини: концентрація розчину і, отже, його густина збільшуються в напрямку від поверхні до дна центрифугувальної пробірки. У міру переміщення молекул білка в центробіжному полі вони розділяються за молекулярною масою: фракції важчих білків при ультрацентрифугуванні розміщуються ближче до дна пробірки, легші білки – ближче до поверхні. При цьому утворюються межі білок-розчинник, які реєструють і розраховують швидкість їх переміщення. Спочатку вираховують константу седиментації білка (S), яка залежить від маси і форми білкової молекули,

,

де υ – швидкість переміщення межі білок-розчинник;

ω – кутова швидкість ротора, рад/с;

r – відстань від центра ротора до середини пробірки із розчином білка, см.

Величина молекулярної маси обчислюється за рівнянням Сведберга

M.M,

де R – газова стала, ерг/(моль×град);

T – абсолютна температура (за шкалою Кельвіна);

S – константа седиментації;

ρ – густина розчинника;

ύ – парціальний питомий об’єм молекули білка;

D – коефіцієнт дифузії.

Цікаво Метод ультрацентрифугування вперше був застосований шведським біохіміком Т. Сведбергом у 1923 р. При швидкості обертання ротора ультрацентрифуги 80000 об/хв він показав, що багато білків складаються з субодиниць. Константа седиментації має розмірність часу (її виражають у секундах). Величину константи седиментації, що дорівнює 1×10-13 с, було взято за одиницю і названо Сведбергом (S).

 

8.2.3. Розділення білків за зарядом. Іонообмінна хроматографія. Метод базується на зв’язуванні іонізованих груп білків із протилежно зарядженими групами іонообмінних смол (катіонообмінників чи аніонообмінників). Щільність зв’язування білка із смолою пропорційна заряду білка. Для розділення кислих і нейтральних білків використовують аніонообмінники для розділення основних білків – катіонообмінники. Білки, адсорбовані на іонообмінному полімері, можна змити буферним розчином із наростаючими концентраціями солі: чим менший заряд білка, тим менша концентрація солі потрібна, щоб змити білок, який зв’язаний з іоногенними групами смоли. Прикладами катіонообмінників є сильнокисла полістиренова смола (Dowex-50), слабокисла карбоксиметил (КМ) целюлоза, слабокисла полістиренова смола (Chelex-100). До аніонообмінників належить сильноосновна полістиренова смола (Dowex-1). Цей процес повністю автоматизовано: використовується спеціальний прилад – амінокислотний аналізатор.

Електрофорез на папері. Електрофорез – метод розділення заряджених частинок в електричному полі. Цей метод використовують в основному для фракціонування білків сироватки крові. Розділення сироваткових білків на фракції (альбумін, α₁-глобуліни, α₂-глобуліни, β-глобуліни, γ-глобуліни) стає можливим завдяки тому, що білки сироватки крові в лужному буферному розчині при дії постійного електричного струму мігрують із різною швидкістю внаслідок їх різного за силою негативного заряду. Так, альбумін, що має найбільший негативний заряд молекули, мігрує в електричному полі найшвидше порівняно з іншими білками до позитивно зарядженого анода. Після розділення білки зафарбовують і отримують електрофореграму. Вміст окремої білкової фракції визначають за кількістю зв’язаного з нею барвника (наприклад, бромфенолового синього). Для побудови графіків кількісного співвідношення фракцій за допомогою приладу для оцифрування результатів, який містить фотоелемент, вимірюють інтенсивність забарвлення окремих білкових фракцій (отримують денситограму електрофореграми).

Таблиця 2 – Вміст окремих білкових фракцій у сироватці крові здорової людини

Назва фракції	Концентрація, г/л	Відносний вміст, %
Альбумін	35–50	52–65
α1-глобуліни	2–4	4,2–7,2
α2-глобуліни	5–9	6,8–12
β-глобуліни	6–11	9,3–15
γ-глобуліни	11–15	15–19

 

Рисунок 7 – Схема електрофореграми (А) та денситограма електрофореграми (Б) білків сироватки крові

8.2.4. Розділення білків за зарядом і молекулярною масою. Гель-електрофорез. Цей метод базується на різній швидкості міграції білків і пептидів в електричному полі залежно не лише від знака заряду, а й від молекулярної маси. Носіями для гель-електрофорезу можуть служити поліакриламідний гель, крохмальний гель, агароза та ін. Молекули, що розділяються, рухаються в гелі залежно від їх розміру: ті з них, які мають великі розміри, будуть затримуватися при проходженні через пори гелю. Менші молекули зустрічатимуть менший опір і відповідно рухатимуться швидше. У результаті після проведення електрофорезу великі молекули знаходитимуться ближче до старту порівняно з меншими.

 

Рисунок 8 – Схема розділення білків методом

гель-електрофорезу:

А – нанесення зразків у гель;

Б – камера для електрофорезу;

В – електрофореграма білків

Методом електрофорезу можна розділити білки за молекулярною масою. Для цього використовують електрофорез у поліакриламідному гелі (ПААГ) за наявності додецилсульфату натрію (ДДС-Na). ДДС-Na є дифільною речовиною та містить заряджену й гідрофобну групи. Білки зв’язуються з ДДС-Na своїми гідрофобними радикалами й при цьому денатурують. Таким чином, білки вирівнюються за формою та зарядом. Після цього рухливість білка при електрофорезі залежить тільки від його молекулярної маси.

Додецилсульфат натрію (ДДС-Na)

У випадку використання імунологічних методів для виявлення розділених білків говорять про імуноелектрофорез. На першому етапі проводять електрофоретичне розділення білків у поліакриламідному гелі, після чого білки переносять із гелю на мікропористу нітроцелюлозну мембрану та детектують заданий білок із використанням специфічних до нього антитіл.

Цікаво У 1948 р. за дослідження електрофорезу та адсорбційного аналізу, особливо за відкриття, пов’язані з комплексною природою білків сироватки, шведський біохімік А. Тизеліус був удостоєний Нобелівської премії з хімії.

 

Ізоелектричне фокусування. Це один із найефективніших і найпоширеніших методів фракціонування та очищення білків. Цей метод дозволяє розділити білки, що відрізняються за ізоелектричною точкою тільки на 0,01. Суміш білків, які піддають розділенню, вносять у колонку або наносять на пластину, заповнену електропровідною рідиною. Розділення білків відбувається залежно від їх заряду в градієнті pH, що створюється за допомогою синтетичних сумішей поліамінополікарбонових кислот (амфолітів) під дією електричного поля. Проводять спочатку електрофорез у горизонтальному напрямі. Білки розділяються залежно від величини заряду (рух білка припиняється, коли значення рН дорівнює ізоелектричній точці для даного білка). Потім обробляють пластину розчином ДДС-Na і проводять електрофорез у вертикальному напрямі. Тепер білки розділяються залежно від молекулярної маси. Виявлення білків після їх розділення ізоелектричним фокусуванням проводять тими самими методами, що використовують після звичайного гель-електрофорезу, – забарвленням спеціальними барвниками з урахуванням того, що амфоліти здатні утворювати з ними комплекси.

8.2.5. Розділення білків за здатністю до специфічних взаємодій. Афінна хроматографія. Метод базується на здатності білків міцно зв’язуватися з різними молекулами, але нековалентними зв’язками. Використовується для виділення й очищення ферментів, імуноглобулінів, рецепторних білків.

Молекули речовин (ліганди), з якими специфічно зв’язуються певні білки, ковалентно сполучають з інертним полімером (рисунок 9 (А)). При пропусканні розчину білків через колонку з полімером на колонці адсорбується лише специфічний для даного ліганду білок за рахунок комплементарного зв’язування білка з лігандом. Решта білків вільно виходять із колонки разом із розчинником (рисунок 9 (Б)). Затриманий білок потім можна вимити з колонки за допомогою буферного розчину, що містить у високій концентрації вільний ліганд (рисунок 9 (В, Г)). Часто використовують вільний ліганд, що має вищу спорідненість до білка, ніж у фіксованого на полімері ліганду.

Цей високочутливий метод дозволяє виділити в чистому вигляді дуже малі кількості білка з клітинного екстракту, що містить сотні інших білків. Одним із варіантів цього методу є імуноафінна хроматографія: до частинок полімеру приєднуть антитіла до певного білка, що забезпечує з дуже високою специфічністю затримку на колонці цього білка.

Рисунок 9 – Схема розділення білків методом афінної хроматографії

8.3. Аналіз будови білків

8.3.1. Аналіз гомологічних білків. Гомологічні білки – білки, які виконують одну й ту саму функцію, але відрізняються за первинною структурою (наприклад, білки, що локалізовані в різних органах чи утворюються при патологічних станах). Наприклад, HbA Þ HbS (замість залишку Glu в 6-му положенні β-ланцюга містить Val) при серпоподібноклітинній анемії.

·      Метод пептидних карт (метод відбитків пальців, або дактилографічний аналіз) був запропонований В. Інгремом. Він являє собою поєднання високовольтного електрофорезу та хроматографії на папері. Принцип методу полягає в тому, що білки, які порівнюються, піддають ферментативному гідролізу до пептидів. Найчастіше з цією метою використовують трипсин. Утворену суміш пептидів кожного білка наносять у вигляді плями на куточок аркуша хроматографічного паперу та проводять електрофоретичне розділення фрагментів у горизонтальному напрямку. Пептиди містять у своєму складі різні амінокислоти і відрізняються один від одного за зарядом, отже, під дією електричного поля розміщуються на аркуші хроматографічного паперу у різних зонах. Отриману електрофореграму піддають хроматографії у вертикальному напрямку. Після таких операцій хроматографічний папір обробляють розчином нінгідрину в ацетоні. У результаті нінгідринової реакції пептиди набувають пурпурового кольору. Отримані таким чином “дактилограми” порівнюють за топографією пептидів та роблять висновок про ступінь подібності первинних структур вихідних білків.

8.3.2. Встановлення амінокислотного складу білка. До визначення амінокислотної послідовності виділеного білка бажано мати уявлення про його амінокислотний склад, тобто знати, які амінокислоти і в якій кількості входять до складу його молекули. Для цього проводять повний гідроліз білка з наступним кількісним аналізом амінокислот, що вивільнилися. Найчастіше використовують кислотний гідроліз. Поліпептид розчиняють у 6 N HCl за відсутності кисню, щоб запобігти окисненню сірковмісних амінокислот. Суміш нагрівають до 100-120 °С і витримують при цій температурі упродовж 10-           100 годин. Однак при цьому способі гідролізу деякі амінокислоти (серин, триптофан, тирозин, глутамін, аспарагін) руйнуються. Амінокислотний склад поліпептидного гідролізату визначають шляхом іонообмінної хроматографії з використанням автоматичного амінокислотного аналізатора. Ідентифікують амінокислоти за елюційним об’ємом, а їх кількість визначають за інтенсивністю флуоресценції після проведення реакції з дансилхлоридом.

8.3.3. Визначення N-кінцевої амінокислоти. Метод Сенджера (запропонований у 1945 р.) – вільна непротонована аміногрупа N-кінцевої амінокислоти білка чи пептиду реагує з динітрофторбензолом (ДНФБ) у лужному середовищі з утворенням забарвлених у жовтий колір ДНФ-похідних білка чи пептиду. При подальшому кислотному гідролізі утворюється суміш ДНФ-похідного N-кінцевої амінокислоти та вільних амінокислот, що входять до складу досліджуваного білка. Структура N-кінцевої амінокислоти встановлюється за “свідком” при хроматографуванні ДНФ-похідних еталонних амінокислот.

 

Метод має обмежену специфічність. ДНФБ реагує не тільки з α-аміногрупою кінцевої амінокислоти, але й із ε-аміногрупою лізину, SH-групою цистеїну, ОН-групою тирозину, імідазольною групою гістидину. Проте ε-ДНФ-лізин легко відрізнити за допомогою спеціального свідка, а всі решта побічні ДНФ-похідні є безбарвними і не заважають проведенню аналізу на N-кінцеву амінокислоту.

Метод Едмана (запропонований шведським біохіміком П.Едманом у 1950-1956 рр.): до розчину пептиду додають реактив Едмана, що містить фенілізотіоціанат (ФІТЦ), який зв’язується з α-аміногрупою першої N-кінцевої амінокислоти з утворенням фенілтіокарбамоїл (ФТК)-пептиду оранжевого кольору. Після цього відбувається відщеплення в кислому середовищі від ФТК-пептиду фенілтіогідантоїнового (ФТГ)-похідного N-кінцевої амінокислоти та його ідентифікація. Потім зазначені етапи повторюються з наступною N-кінцевою амінокислотою досліджуваного пептиду. Найважливішою перевагою розщеплення за методом Едмана порівняно з іншими методами визначення N-кінцевої амінокислоти є те, що відбувається послідовне вкорочення пептиду з N-кінця на один мономер без руйнування пептидних зв’язків між іншими амінокислотними залишками, що дозволяє з’ясувати амінокислотну послідовність досліджуваного пептиду. Цей процес автоматизований – використовують спеціальний прилад – “секвенатор” (від англ. “sequence” – послідовність), що дозволяє аналізувати з високою ефективністю продукти білкового гідролізу і природні пептиди.

 

Взаємодія N-кінцевої амінокислоти із дансил-хлоридом  (1-диметиламінонафталін-5-сульфохлорид, ДНС) із утворенням ДНС-похідних білків та пептидів. Після подальшого кислотного гідролізу відбувається вивільнення з поліпептидного ланцюга  N-кінцевої ДНС-амінокислоти, що має інтенсивну жовту флуоресценцію. Після цього проводять хроматографічну ідентифікацію ДНС-амінокислот.

 

Ферментативний метод (використання амінопептидаз – це ферменти, які вибірково відщеплюють N-кінцеві амінокислоти). Найбільш вивченим ферментом цього типу є лейцинамінопептидаза. Її виділяють із нирок свиней. За допомогою цього ферменту були встановлені, зокрема,             N-кінцеві амінокислоти інсуліну та рибонуклеази. Фермент погано відщеплює N-кінцеві амінокислоти, якщо вони зв’язані з лізином, аргініном та ароматичними амінокислотами.

8.3.4. Визначення С-кінцевої амінокислоти. Метод Акаборі (поліпептид обробляють безводним гідразином при температурі 90 °С упродовж 20-100 годин за наявності іонообмінного сорбенту (як каталізатора). Гідразин реагує з карбонільною групою кожного пептидного зв’язку, розщеплюючи його з утворенням ацилгідразидних похідних усіх амінокислотних залишків, крім С-кінцевого. С-кінцева амінокислота не піддається модифікації, оскільки її α-СООН група не бере участі в утворенні пептидного зв’язку. С-кінцеву амінокислоту ідентифікують хроматографічно після обробки суміші ДНФБ).

Ферментативний метод (карбоксипептидази А відщеплюють ароматичні С-кінцеві амінокислоти, карбоксипептидази В – основні С-кінцеві амінокислоти).

8.3.5. Визначення амінокислотної послідовності білкового ланцюга. Встановлення кінцевих амінокислот у досліджуваному пептиді дозволяє в подальшому визначити всю його амінокислотну послідовність. Для цього, як правило, проводять повторне розщеплення за методом Едмана (як описано вище). Використовують прилад секвенатор, запропонований П. Едманом і Г. Бегом. Секвенатор визначає один амінокислотний залишок за годину. Таким способом можна встановити послідовність розміщення 40-60 залишків амінокислот. Щоб встановити послідовність розміщення амінокислот у великих поліпептидних молекулах, їх піддають розщепленню ферментативним або хімічним шляхом на фрагменти із розмірами, достатніми для проведення секвенування.

9. Коротка історична довідка

1820 р. – виділено першу амінокислоту – гліцин – із кислотного гідролізату желатину (А. Браконно);

1838 р. – уперше проведено систематичні дослідження білків (Г. Мульдер);

1838 р. – запропоновано термін “протеїн” (Я. Берцеліус);

1871 р. – встановлено факт розщеплення білка (казеїну) до амінокислот травними соками (М. Любавін);

1902 р. – відкриття пептидного зв’язку (Е. Фішер);

1910 р. – висунуто ідею про те, що білки побудовані в основному з амінокислот (А. Коссель);

20-ті роки XX ст. – визначення молекулярної маси білків методом ультрацентрифугування (Т. Сведберг);

1935 р. – відкрито треонін – останню з числа незамінних амінокислот (А. Розе);

1948 р. – за розроблення методу електрофорезу у вільній фазі А. Тизеліус нагороджений Нобелівською премією;

1951 р. – сформульовано теорію формування вторинної структури білка – теорію спіралей (Л. Полінг і Р. Корі). Нобелівська премія 1952 р.;

1952 р. – за розроблення методу розподільної хроматографії на папері А. Мартін і Р. Сінг нагороджені Нобелівською премією;

1955 р. – встановлено первинну структуру інсуліну              (Ф. Сенджер). Нобелівська премія 1952 р.;

1962 р. – встановлено просторову структуру білків за допомогою рентгеноструктурного аналізу (М. Перутц,            Дж. Кендрю).

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1.      Березов Т.Т. Биологическая химия : учебник / Т. Т. Березов, Б. Ф. Коровкин.– 3-е изд., перераб. и доп. – М. : Медицина, 1998. – 704 с. – ISBN 5-225-02709-1.

2.      Биологическая химия с упражнениями и задачами : учебник / С. Е. Северин, Л. В. Авдеева, А. Е. Губарева [и др.]; под ред. С. Е. Северина. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2012. – 624 с. –    ISBN 978-5-9704-2189-5.

3.      Биологическая химия : учебник / В. К. Кухта,                          Т. С. Морозкина, Э. И. Олецкий [и др.]; под ред.                   А. Д. Тагановича. – М.: Бином, 2008. – 688 с. –                 ISBN 978-5-9518-0261-3.

4.      Биохимия : учебник / Л. В. Авдеева, Т. Л. Алейникова,         Л. Е. Андрианова [и др.]; под ред. Е. С. Северина. – 5-е изд., испр. и доп. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 768 с. –                       ISBN 978-5-9704-2029-4.

5.      Гонський Я. І. Біохімія людини / Я. І. Гонський,                    Т. П. Максимчук. – Тернопіль : Укрмедкнига, 2001. – 736 с. – ISBN 966-7364-17-8.

6.      Губський Ю. І. Біологічна хімія: підручник / Ю.І. Губський. – Київ-Вінниця : Нова книга, 2009. – 664 с. –                                 ISBN: 978-966-382-186-3.

7.      Жеребцов Н. А. Биохимия : учебник / Н. А. Жеребцов,          Т. Н. Попова, В. Г. Артюхов. – Воронеж : Издательство Воронежского государственного университета, 2002. – 696 с. – ISBN: 5-7455-1183-4.

8.      Клінічна біохімія : підручник / Д. П. Бойків, Т. І. Бондарчук, О. Л. Іванків [та ін.]; за ред. О. Я. Склярова. – К. : Медицина, 2006. – 432 с. – ISBN 966-8144-32-5.

9.      Кучеренко М. Є. Сучасні методи біохімічних досліджень : навчальний посібник / М. Є. Кучеренко, Ю. Д. Бабенюк,           В. М. Войціцький. – К. : Фітосоціоцентр, 2001. – 424 с. – ISBN: 966-7938-21-2.

10.  Ленинджер А. Основы биохимии : в 3 т. / А. Ленинджер; пер. с англ. В. В. Борисова, М. Д. Гроздовой,                                  С. Н. Преображенского [под ред. В.А. Энгельгардта,            Я. М. Варшавского]. – М. : Мир, 1985. – 1055 с.

11.  Маршалл Вильям Дж. Клиническая биохимия /                      В. Дж. Маршалл; пер. с англ. А. Г. Голубева, Е. М. Еропкина, М. Ю. Еропкина, М. Г. Королёва [науч. ред. Н. И. Новиков; ред. Е. С. Лебедева]. – СПб. : Невский Диалект, 1999. – 368 с. – ISBN 5-7940-0024-4.

12.  Чиркин А. А. Биохимия / А. А. Чиркин, Е. О. Данченко. – М.: МедЛит, 2010. – 608 с. – ISBN 978-5-91803-002-8.

13.  Шендрик А. Н. Химия белка. Структура, свойства, методы исследования: учеб. пособие для студ. спец. “Биохимия” /       А. Н. Шендрик. – Донецк : Норд-пресс, 2004. – 346 с. –    ISBN 966-8085-50-7.

14.  Шугалей И. В. Химия белка : учебное пособие /                     И. В. Шугалей, А. В. Гарабаджиу, И. В. Целинский. – СПб. : Проспект Науки, 2011. – 200 с. – ISBN: 978-5-903090-54-9.

15.  Щербак И. Г. Биологическая химия : учебник /                       И. Г. Щербак. – СПб. : Издательство СПбГМУ, 2005. – 480 с. – ISBN: 5-88999-052-7.

Додаток А

(обов’язковий)

Таблиця А.1 – Характеристика протеїногенних амінокислот

Назва	Скорочення	pK α-NH3-групи	pK α-СООН-групи	pK R-групи	pI	Молеку-лярна маса (Да)
Аланін	A, Ала, Ala	2,34	9,69	–	6,02	71,08
Аргінін	R, Арг, Arg	2,17	9,04	12,48	10,76	156,20
Аспарагін	N, Асн, Asn	2,02	8,80	–	5,41	114,11
Аспарагіно-ва кислота	D, Асп, Asp	2,09	9,82	3,86	2,97	115,09
Валін	V, Вал, Val	2,32	9,62	–	5,97	99,14
Гліцин	G, Глі, Gly	2,34	9,60	–	5,97	57,06
Глутамін	Q, Глн, Gln	2,17	9,13	–	5,65	128,14
Глутамінова кислота	E, Глу, Glu	2,19	9,67	4,25	3,22	129,12
Гістидин	H, Гіс, His	1,82	9,17	6,0	7,58	137,15
Ізолейцин	I, Іле, Ile	2,36	9,68	–	6,02	113,17
Лейцин	L, Лей, Leu	2,36	9,68	–	5,98	113,17
Лізин	K, Ліз, Lys	2,18	8,95	10,53	9,74	128,18
Метіонін	M, Мет, Met	2,28	9,21	–	5,75	131,21
Пролін	P, Про, Pro	1,99	10,6	–	6,10	97,12
Серин	S, Сер, Ser	2,21	9,15	–	5,68	87,08
Треонін	T, Тре, Thr	2,63	10,43	–	6,53	101,11
Триптофан	W, Три, Trp	2,38	9,39	–	5,88	186,21
Тирозин	Y, Тир, Tyr	2,20	9,11	10,07	5,65	163,18
Фенілаланін	F, Фен, Phe	1,83	9,13	–	5,98	147,18
Цистеїн	C, Цис, Cys	1,71	10,78	8,33	5,02	103,14